朱 波,倪一平

(深圳市羅湖區(qū)疾病預防控制中心,深圳 518020)

貝類毒素是海洋毒素中對人類健康影響較大的一類毒素,主要由水體中產(chǎn)毒藻類或微生物產(chǎn)生,按照中毒癥狀可將其分為麻痹性貝類毒素、腹瀉性貝類毒素、神經(jīng)性貝類毒素、記憶缺失性貝類毒素等四大類[1-2]。神經(jīng)性貝類毒素主要為短凱倫藻產(chǎn)生的短裸甲藻毒素(Pbtx),該毒素可導致魚類大量死亡,牡蠣、蛤和貽貝等雙殼貝類則對其不敏感。對于長期生長在毒藻分布水域中的雙殼貝類,雖然其外表呈現(xiàn)完全健康的狀態(tài),但體內(nèi)卻在富集毒素,消除半衰期長達數(shù)十天甚至數(shù)月。Pbtx熱穩(wěn)定性較好,加熱、微波等常規(guī)加工處理方式無法消除毒素,反而會因處理過程中貝類食物含水量降低而導致毒素濃度水平顯著升高。當消費者食用被污染的雙殼貝類后,可能產(chǎn)生惡心、嘔吐、腹瀉、痙攣、支氣管收縮、麻痹、昏迷等神經(jīng)性中毒癥狀[3-4]。同時,Pbtx能夠通過空氣傳播,被人吸入后,引起氣喘、咳嗽等中毒癥狀[5]。按照基本結構,Pbtx可分為A 型(Pbtx-A)、B型(Pbtx-B)及十幾種衍生物,其中Pbtx-B 最常見[6]。Pbtx主要分布在美洲墨西哥灣沿岸和新西蘭豪拉基海灣,但目前已有研究表明,其他海域也受到了此毒素的侵擾[7]。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)、世界衛(wèi)生組織(WHO)、歐盟、加拿大、新西蘭、澳大利亞等規(guī)定貝類中Pbtx限量為20 MUs/100 g,我國暫無相應限量的規(guī)定[8]。因此,有必要對雙殼貝類中Pbtx的含量進行監(jiān)控。

目前,Pbtx 的檢測方法主要有小鼠生物測定法[9]、體外分析法(細胞毒性試驗[10]、受體結合試驗[11])、免疫分析法(放射免疫法[12]、酶聯(lián)免疫法[13])、液相色譜-串聯(lián)質譜法[14-15]等。小鼠生物測定法雖然是發(fā)展較早、較常用的分析方法,但存在特異性、重現(xiàn)性、靈敏度都很差,耗時長,容易出現(xiàn)假陽性結果等問題。體外分析法和免疫分析法均無法準確定性定量,并且容易受交叉反應的影響,出現(xiàn)假陽性或者假陰性結果。液相色譜-串聯(lián)質譜法兼具液相色譜法和質譜法的優(yōu)勢,具有靈敏度高、定性定量準確等特點,越來越廣泛地被應用在Pbtx 的檢測中。在采用該方法測定時,雖然使用了固相萃取[16]、液液萃取[17]等方法凈化樣品,但仍存在特異性不強、提取效率不佳等問題,降低了方法的應用推廣價值。

免疫親和柱凈化技術利用抗原抗體特異性結合,能夠在有效富集毒素的同時凈化樣品,減少了基質干擾,提高了方法靈敏度和準確度,已被應用于生物毒素檢測中[18-19]。多反應監(jiān)測-信息依賴性分析-增強子離子(MRM-IDA-EPI)為超高效液相色譜-三重四極桿復合線性離子阱質譜儀的特有掃描模式,能夠實現(xiàn)一次采樣同時獲得兩種采集模式下的數(shù)據(jù),即在獲得MRM 定量結果的同時完成目標物的二級質譜掃描,通過目標物的二級質譜圖與標準二級質譜圖的比對,完成雙重定性,提高定性分析的準確度[20]。本工作采用免疫親和柱前處理樣品,結合MRM-IDA-EPI掃描模式測定雙殼貝類中Pbtx-B的含量,可為海產(chǎn)品中Pbtx的食品風險監(jiān)測評估、養(yǎng)殖海域環(huán)境及生物中Pbtx的本地污染調(diào)查,以及因食用被毒素污染的貝類而中毒的患者的病因診斷及臨床救治提供先進可靠的技術支持。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

TripleQuad 5500+型超高效液相色譜-三重四極桿復合線性離子阱質譜儀;3-30KS型臺式冷凍離心機;Visiprep 型固相萃取裝置;Millipore Q 型純水系統(tǒng)。

標準儲備溶液:10 mg·L-1,用甲醇將Pbtx-B標準品0.1 mg完全溶解并定容于10 mL 容量瓶中,于-20 ℃保存。其他標準溶液均由該溶液用甲醇逐級稀釋制得。

磷酸鹽緩沖液(PBS):pH 7.3,取十二水合磷酸氫二鈉6.45 g、二水合磷酸二氫鈉1.09 g、氯化鈉4.25 g,用水溶解并定容于500 mL容量瓶中。

Pbtx-B標準品的純度為95%;甲醇、甲酸、甲酸銨均為色譜純;十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、氯化鈉均為分析純;試驗用水為超純水。

試驗樣品均隨機購自當?shù)啬乘a(chǎn)市場,包括扇貝、貽貝、牡蠣、帶子、青口、馬刀貝等水產(chǎn)品,分析前于-20 ℃冷凍保存。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Poroshell 120 EC-C18色譜柱(100 mm ×2.1 mm,2.7μm);柱溫40℃;進樣量10μL;流動相A 為10 mmol·L-1甲酸銨-0.1%(體積分數(shù),下同)甲酸溶液,B為甲醇;流量0.3 mL·min-1。梯度洗脫程序:0～1.0 min時,A 為80%;1.0～4.0 min時,A 由80%降至10%,保持5.0 min;9.0～9.1 min時,A 由10%跳轉至80%,保持2.9 min。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子源正離子(ESI+)模式;離子化電壓5 500 V;離子源溫度550 ℃;氣簾氣壓力241 k Pa,噴霧氣壓力379 kPa,輔助加熱氣壓力379 k Pa;接口加熱功能為開啟;碰撞氣壓力模式為高模式;入口電壓10 V,出口電壓10 V;MRM-IDA-EPI掃描模式。IDA 參數(shù):動態(tài)背景扣除;MRM 信號觸發(fā)EPI閾值500 cps。EPI參數(shù):碰撞能量35 e V;擴展能量15 eV。Pbtx-B母離子質荷比(m/z)895.5;去簇電壓80 V;特征子離子m/z859.6,877.5(定量離子),碰撞能量分別為26,33 eV。

1.3 試驗方法

取1.0 g(精確至0.001 g)充分勻質的樣品于離心管中,加入80%(體積分數(shù),下同)甲醇溶液4 mL,渦旋2 min后超聲提取10 min。以8 000 r·min-1轉速于4 ℃冷凍離心5 min,上清液轉移至另一個潔凈的離心管中,重復提取一次。合并上清液,用80%甲醇溶液稀釋至10 mL,充分混勻。分取5 mL,加入20 mL PBS,渦旋混勻,待凈化。以保存液活化神經(jīng)性貝類毒素免疫親和柱,將待測液過柱,用20%(體積分數(shù))甲醇溶液3 mL 淋洗,待淋洗液流干后,適當加壓徹底排干柱內(nèi)殘留液體,加入甲醇3 mL洗脫,過程中確保溫度為室溫,過柱速率為2～3 mL·min-1。收集洗脫液,并完全混勻,分取1.0～1.5 mL 置于離心管中,用10 000 r·min-1轉速離心10 min,上清液按照儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 免疫親和柱的使用效果

為了驗證免疫親和柱的使用效果,分別進行了回收試驗和基質效應試驗。在80%甲醇溶液5 mL中加入適量標準溶液,使Pbtx-B 加標量達到50μg·L-1,充分混勻后加入20 mL PBS,按照試驗方法測定,所得Pbtx-B 的回收率大于80.0%,準確度滿足試驗需求。分別以空白基質溶液和甲醇配制100μg·L-1標準溶液,按照儀器工作條件測定,以二者峰面積的比值計算基質效應值,所得結果為98.8%,說明采用免疫親和柱凈化樣品可有效降低基質效應。

2.2 色譜條件的選擇

結合Pbtx-B親脂的性質,常規(guī)C18色譜柱即可滿足分離需求,同時對梯度洗脫程序、流量、柱溫等色譜條件進行優(yōu)化,所得參數(shù)見1.2.1節(jié)。在此條件下,目標物色譜峰峰形尖銳、對稱,基線平穩(wěn),目標物在7 min內(nèi)即可得到較好分離。

2.3 質譜條件的選擇

根據(jù)Pbtx-B分子結構,選擇在ESI+模式下檢測,采用針泵進樣,在確定母離子和子離子的m/z后分別優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量等質譜參數(shù),使Pbtx-B的響應信號最大,得到MRM 模式下Pbtx-B的總離子流色譜圖,結果見圖1。

圖1 Pbtx-B的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of Pbtx-B

在MRM 采集條件的基礎上建立MRM-IDAEPI掃描模式,用標準物質獲得Pbtx-B的標準二級質譜圖并加入譜庫。根據(jù)Pbtx-B 的響應值合理設定IDA 中信號強度閾值,當樣品中可疑色譜峰的響應值超過設置的IDA 閾值時,質譜在1 ms內(nèi)自動將Q3切換為線性離子阱,并對該MRM 通道的母離子執(zhí)行EPI,在低(20 eV)、中(35 eV)、高(50 e V)碰撞能量下分別掃描碎片離子,3個碰撞能量所得的碎片離子混合圖即為二級質譜圖。軟件在譜庫中搜索對應的標準二級質譜圖,并自動計算二者的相似程度百分比,結合常規(guī)方法學驗證,從而實現(xiàn)對目標物的定性確證。

2.4 標準曲線和檢出限

按照儀器工作條件測定質量濃度分別為5,10,20,50,200,500μg·L-1的標準溶液系列,以Pbtx-B的質量濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示,Pbtx-B標準曲線的線性范圍為5～500μg·L-1,線性回歸方程為y＝2.145×103x-9.738×103,相關系數(shù)為0.996 8。

按照試驗方法制備并測定加標空白樣品溶液,以3倍信噪比(S/N)對應的質量濃度計算檢出限(3S/N),結果為30μg·kg-1。

2.5 精密度和回收試驗

在陰性扇貝樣品中添加低(檢出限)、中(5倍檢出限)、高(10倍檢出限)等3個濃度水平的標準溶液,每個濃度水平做6 個平行樣,按照試驗方法分析,每個樣品均重復測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表1。

表1 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.6 樣品分析

按照試驗方法分析扇貝、貽貝、牡蠣、帶子、青口、馬刀貝等水產(chǎn)品,均未檢出Pbtx-B,與相關文獻[21]的研究結果基本一致。

同步分析加標樣品(加標量150μg·kg-1),并在標準譜庫中對EPI模式下采集的二級質譜圖進行匹配性檢索。結果顯示,二者二級質譜圖的匹配度值、反匹配度值、純度值均大于60%,相似度較高,說明本方法可用于雙殼貝類中Pbtx-B的檢測。

本工作采用免疫親和柱凈化技術結合MRMIDA-EPI模式檢測雙殼貝類中的Pbtx-B,該方法特異性強、定性定量準確,彌補了暫無相關國家標準方法的短板,具有很好的應用前景。