翟 倩,楊文霞,李 佳,高亞娟

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科,西安 710032)

流動(dòng)注射是在熱力學(xué)非平衡狀態(tài)下即可完成樣品在線處理與測(cè)定的動(dòng)態(tài)定量分析技術(shù)[1]。該技術(shù)在1975年由丹麥學(xué)者RUZIKA 和HANSEN 首次提出,目前已被廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域,促進(jìn)了分析自動(dòng)化的發(fā)展[2]。流動(dòng)注射作為一種簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化的進(jìn)樣和分離技術(shù),常與其他測(cè)定方法聯(lián)用,例如原子吸收光譜法[3-4]、高效液相色譜法[5]、化學(xué)發(fā)光法[6]以及毛細(xì)管電泳法[7]等。化學(xué)發(fā)光法是一種高靈敏度的檢測(cè)方法,在化學(xué)成分分析中應(yīng)用廣泛[8]。流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法集二者的優(yōu)點(diǎn)于一身,具有靈敏度高、分析快速、分析成本低、線性范圍寬、操作簡(jiǎn)單且無(wú)需任何激發(fā)光源等優(yōu)勢(shì),已被廣泛應(yīng)用于藥物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品分析、生命科學(xué)等領(lǐng)域中[9-12]。目前,該方法在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用尚無(wú)系統(tǒng)性的文獻(xiàn)總結(jié)。鑒于此,本工作綜述了流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法的原理、特點(diǎn)及主要的化學(xué)發(fā)光體系,以及該方法在近二十年國(guó)內(nèi)外藥物分析領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展,并對(duì)該方法的應(yīng)用前景和發(fā)展趨勢(shì)做出展望。

1 簡(jiǎn)要介紹

1.1 流動(dòng)注射技術(shù)

在進(jìn)行流動(dòng)注射測(cè)試時(shí),需要把一定量的樣品注入無(wú)氣泡間隔的流動(dòng)試劑中,在非平衡狀態(tài)下完成樣品的在線處理與分析。與傳統(tǒng)的化學(xué)分析法相比,它不需要反應(yīng)物之間達(dá)到化學(xué)平衡,故可獲得均勻平衡體系無(wú)法提供的信息,能很好地應(yīng)用于不穩(wěn)定反應(yīng)的定量分析中,是分析技術(shù)的一次革新[13]。該技術(shù)大大提高了分析方法的分析速率、選擇性和靈敏度,具有儀器裝置體積小、操作簡(jiǎn)單、分析快速、靈敏度高、結(jié)果重復(fù)性好和檢出限低等優(yōu)點(diǎn),廣泛適用于動(dòng)力學(xué)反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)、生物發(fā)光反應(yīng)以及低穩(wěn)定的反應(yīng)體系[14-15],而與其他技術(shù)的連用[16-17],大大拓展了該技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域。

1.2 化學(xué)發(fā)光法

化學(xué)發(fā)光法是一種由化學(xué)反應(yīng)引起的光輻射現(xiàn)象,其發(fā)光原理是反應(yīng)體系中的某些物質(zhì)分子如反應(yīng)物、中間體或者熒光物質(zhì)吸收了反應(yīng)釋放的能量,由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài),然后再?gòu)募ぐl(fā)態(tài)返回基態(tài),將能量以光輻射的形式釋放出來(lái),從而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光[18]?；瘜W(xué)發(fā)光法是基于反應(yīng)體系中待測(cè)物含量和體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在一定條件下呈線性關(guān)系來(lái)進(jìn)行定量分析的,是一種具有超高靈敏度的痕量分析方法,近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于痕量金屬離子、無(wú)機(jī)化合物、有機(jī)化合物及生物分析等領(lǐng)域[19-21]?；瘜W(xué)發(fā)光法中的發(fā)光體系大致有4 類[22]:無(wú)機(jī)離子-化學(xué)發(fā)光體系、無(wú)機(jī)離子催化-氧化劑-化學(xué)發(fā)光體系、無(wú)機(jī)離子催化有機(jī)物的氧化-化學(xué)發(fā)光體系、乳化劑-化學(xué)發(fā)光體系。近年來(lái)常用于流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法的發(fā)光體系如下所示。

1.2.1 魯米諾化學(xué)發(fā)光體系

魯米諾(Luminol)試劑是應(yīng)用最早、最廣泛的化學(xué)發(fā)光試劑之一,具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、性質(zhì)穩(wěn)定、易于合成、水溶性較好且安全無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)。在堿性條件下,Luminol試劑可被很多氧化劑(過(guò)氧化氫、高碘酸、鐵氰化鉀、高錳酸鉀等)氧化而處于激發(fā)態(tài),激發(fā)態(tài)再回到基態(tài),會(huì)發(fā)出425 nm 的藍(lán)光。由于Luminol試劑化學(xué)發(fā)光體系的反應(yīng)速率較慢、發(fā)光強(qiáng)度較弱,常常需要在反應(yīng)體系中添加無(wú)機(jī)催化劑(Mn2+、Cr3+、Fe3+、Fe2+、Co2+、Cu2+等)或酶類化合物(辣根過(guò)氧化酶、過(guò)氧化氫酶、微過(guò)氧化酶、黃嘌呤氧化酶等)[23],也可以直接用一些待測(cè)藥物作催化劑或增敏劑,或間接通過(guò)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生這些催化劑或增敏劑,使發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)或抑制,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的檢測(cè)。

1.2.2 吖啶酯類化合物化學(xué)發(fā)光體系

光澤精(N,N-二甲基二吖啶硝酸鹽)是最早被發(fā)現(xiàn)且應(yīng)用最廣泛的一種吖啶酯類發(fā)光試劑。在堿性介質(zhì)中,光澤精被氧化為四元環(huán)過(guò)氧化物中間體,而后裂解生成激發(fā)態(tài)的吖啶酮,回到基態(tài)時(shí)會(huì)發(fā)出440 nm 的藍(lán)綠光,過(guò)氧化氫等氧化劑可大大增強(qiáng)其發(fā)光強(qiáng)度。與Luminol試劑相比,光澤精發(fā)光效率更高[24],很多吖啶酯類化合物也具有同樣的化學(xué)發(fā)光特征,已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域。

1.2.3 過(guò)氧化草酸酯化學(xué)發(fā)光體系

過(guò)氧化草酸酯化學(xué)發(fā)光體系的主要組分包括芳香草酸酯、過(guò)氧化氫和熒光劑,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最高效的非生物化學(xué)發(fā)光體系。在合適的熒光劑存在下,過(guò)氧化氫會(huì)氧化芳香草酸酯,產(chǎn)生具有高能量、不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物過(guò)氧草酸酯,熒光劑接收能量呈激發(fā)態(tài),再回到基態(tài)時(shí)釋放光子產(chǎn)生光輻射[25]。此反應(yīng)體系的發(fā)光強(qiáng)度與熒光劑特性有關(guān),而與化學(xué)發(fā)光試劑種類和性質(zhì)無(wú)關(guān)。但是,由于該發(fā)光體系反應(yīng)物的水溶性較差且不穩(wěn)定,其在化學(xué)分析中的應(yīng)用有限。

1.2.4 Ce(Ⅳ)化學(xué)發(fā)光體系

在酸性介質(zhì)中,Ce(Ⅳ)具有很強(qiáng)的氧化性,可以與很多還原性無(wú)機(jī)化合物或有機(jī)化合物發(fā)生氧化還原反應(yīng),Ce(Ⅳ)被還原生成激發(fā)態(tài)的Ce(Ⅲ)*,產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,目前已應(yīng)用于很多藥物的化學(xué)發(fā)光分析中[26]。

1.2.5 高錳酸鉀化學(xué)發(fā)光體系

高錳酸鉀具有強(qiáng)氧化性,在酸性介質(zhì)中,大部分有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物都可以與其發(fā)生氧化還原反應(yīng)并產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。高錳酸鉀化學(xué)發(fā)光體系具有發(fā)光強(qiáng)度穩(wěn)定、成本低和適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),在化學(xué)分析領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛[27]。

1.2.6 釕聯(lián)吡啶化學(xué)發(fā)光體系

Ru(bipy)32+具有獨(dú)特的化學(xué)穩(wěn)定性、氧化還原性和發(fā)光性,在酸性介質(zhì)中,能與氧化劑反應(yīng)產(chǎn)生Ru(bipy)33+,可被某些待測(cè)有機(jī)化合物還原為激發(fā)態(tài)的[Ru(bipy)32+]*,其返回基態(tài)時(shí)會(huì)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,發(fā)光強(qiáng)度與有機(jī)化合物含量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,以此完成對(duì)有機(jī)化合物的定量分析[28]。

1.2.7 亞硫酸鹽化學(xué)發(fā)光體系

亞硫酸鹽可以被某些強(qiáng)氧化劑氧化產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,而一些有機(jī)化合物可以增強(qiáng)該體系的發(fā)光強(qiáng)度。亞硫酸鹽含量在一定范圍內(nèi)與發(fā)光強(qiáng)度成正比,以此完成對(duì)這些有機(jī)化合物的定量分析[29]。

1.3 流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法

該方法最初主要應(yīng)用于一些離子的定量分析,隨著方法的不斷改進(jìn),逐漸用于復(fù)雜待測(cè)物的分析[30]。流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光分析測(cè)試系統(tǒng)主要由載流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)、反應(yīng)器、檢測(cè)器和信號(hào)檢測(cè)裝置組成[31],見(jiàn)圖1。

由圖1可知,反應(yīng)溶液經(jīng)蠕動(dòng)泵泵入,經(jīng)六通閥混合后進(jìn)入檢測(cè)池發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng),產(chǎn)生的光學(xué)信號(hào)經(jīng)光電倍增管放大,計(jì)算機(jī)讀出檢測(cè)信號(hào),以待測(cè)物含量和峰高繪制校正曲線,并計(jì)算分析結(jié)果。

圖1 流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法流路圖Fig.1 Flow diagram of flow injection-chemiluminescence

2 在藥物分析中的應(yīng)用

藥物分析在藥物研發(fā)、生產(chǎn)以及臨床應(yīng)用中有重要作用[32],常用的分析方法有滴定法、紫外-可見(jiàn)分光光度法、熒光分光光度法、原子吸收光譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層色譜掃描法、電化學(xué)法、紅外光譜法和質(zhì)譜法等[33-37]。滴定法靈敏度低、操作繁瑣且分析耗時(shí)長(zhǎng);熒光分光光度法和高效液相色譜法需要激發(fā)光源和分光系統(tǒng),設(shè)備復(fù)雜、背景信號(hào)高、儀器價(jià)格昂貴;電化學(xué)法不穩(wěn)定且重現(xiàn)性差;光譜法和質(zhì)譜法設(shè)備昂貴,難以廣泛推廣。流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法作為一種具有高靈敏度和較寬線性范圍的痕量分析方法,可以很好地應(yīng)用于藥物的藥效、動(dòng)力學(xué)和機(jī)理等方面的研究。本工作對(duì)近二十年報(bào)道的流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法在維生素類、抗生素類、激素類、抗腫瘤類、中藥及其他類藥物分析中的應(yīng)用做了概述。

2.1 維生素類藥物

維生素是維持細(xì)胞正常生理功能的天然有機(jī)物質(zhì),其中被認(rèn)為對(duì)維持人體健康和促進(jìn)發(fā)育至關(guān)重要的維生素有20余種[38],可用于維生素缺乏癥的預(yù)防和治療,也可作為其他疾病治療的輔助藥物。但是,長(zhǎng)期或過(guò)量服用維生素會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害,因此維生素類藥物的分析對(duì)臨床用藥有很高的價(jià)值[39]。流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法在維生素類藥物分析中的應(yīng)用如表1所示。

表1 流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法在維生素類藥物分析中的應(yīng)用Tab.1 Application of flow injection-chemiluminescence in vitamin drug analysis

2.2 抗生素類藥物

抗生素類藥物是指可消除或者抑制病原微生物的一類藥物,主要包括β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類等[48]?？股仡愃幬锸侵委焺?dòng)物和人類疾病的一種常用藥物,流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法在該類藥物分析中的應(yīng)用如表2所示。

表2 流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法在抗生素類藥物分析中的應(yīng)用Tab.2 Application of flow injectio-chemiluminescence in antibiotics drug analysis

表2 (續(xù))

2.3 激素類藥物

激素類藥物是以人體或動(dòng)物激素(包括與激素結(jié)構(gòu)、作用原理相同的有機(jī)化合物)為有效成分的藥物,可分為糖皮質(zhì)激素、腎上腺皮質(zhì)激素、去甲腎上腺激素、孕激素、雌激素、雄激素等[98]。激素類藥物應(yīng)用廣泛,可用來(lái)預(yù)防、治療、診斷疾病或幫助機(jī)體恢復(fù)正常機(jī)能等。激素類藥物治療效果顯著,但由于其藥理作用復(fù)雜,若應(yīng)用不當(dāng)將帶來(lái)各種不良反應(yīng)。目前報(bào)道的流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法在激素類藥物分析中的應(yīng)用如表3所示。

表3 流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法在激素類藥物分析中的應(yīng)用Tab.3 Application of flow injection-chemiluminescence in hormone drug analysis

2.4 抗腫瘤類藥物

抗腫瘤類藥物包括化療藥物、生物制劑等[114]。流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法在抗腫瘤類藥物分析中的應(yīng)用如表4所示。

表4 流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法在抗腫瘤類藥物分析中的應(yīng)用Tab.4 Application of flow injection-chemiluminescence in antitumor drug analysis

2.5 中藥

中藥是以中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥理論為指導(dǎo),采集、炮制成的一類藥物,它主要來(lái)源于天然藥及其加工品,包括植物藥、動(dòng)物藥、礦物藥及部分化學(xué)、生物制品類藥物,因此中藥具有成分含量不均衡或成分復(fù)雜等特征。流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法可以準(zhǔn)確定量分析中藥中的活性成分,該方法在中藥中的應(yīng)用如表5所示。

表5 流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法在中藥分析中的應(yīng)用Tab.5 Application of flow injection-chemiluminescence in traditional Chinese medicine analysis

2.6 其他類藥物

流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法還可以用于其他多種藥物的分析,例如生物堿類藥物,多巴胺、類中樞神經(jīng)藥物,解毒鎮(zhèn)痛抗炎性藥物,免疫抑制藥等見(jiàn)表6。

表6 流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法在其他類藥物分析中的應(yīng)用Tab.6 Application of flow injection-chemiluminescence in other drug analysis

3 問(wèn)題和展望

流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法分析快速、精密度和靈敏度高,在藥物分析中應(yīng)用廣泛,但是仍存在一些亟待解決的問(wèn)題:①發(fā)光體系的靈敏度還達(dá)不到某些痕量分析的期望,方法檢出限和實(shí)際要求仍有一定差距,需要尋找更好的發(fā)光試劑、發(fā)光體系或者增敏劑;②成分復(fù)雜的藥物中的干擾物質(zhì)較多,方法的抗干擾能力和選擇性有待提高;③需設(shè)計(jì)更加便攜和自動(dòng)化更高的流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光分析儀,使其易于推廣和實(shí)現(xiàn)復(fù)雜體系的有效檢測(cè);④流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法在推廣應(yīng)用前,需要進(jìn)行大量的試驗(yàn)和考查論證。

隨著發(fā)光體系的不斷優(yōu)化、高效發(fā)光體系與發(fā)光試劑的開(kāi)發(fā)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)及其靈敏度的逐漸提高,流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法在藥物化學(xué)、免疫分析、礦物分析、臨床醫(yī)藥、環(huán)境檢測(cè)和生命科學(xué)等領(lǐng)域中有著巨大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景。