崔晟頔，張力戈，張松源，詹鳳婷，李秀領(lǐng)，喬瑞敏，韓雪蕾，李新建，王克君

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河南鄭州 450046）

河南地方豬是我國寶貴的種質(zhì)資源。河南地方豬種具有許多優(yōu)良的種質(zhì)特征，如繁殖力高、耐粗飼、肉質(zhì)好等，是河南省養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要資源。藏豬是我國唯一的高原型豬種，也是我國寶貴的地方品種資源。藏豬長期生活于高寒地區(qū)，具有適應(yīng)高寒惡劣條件、耐粗飼、瘦肉率高等特點，但繁殖力較低。由于社會經(jīng)濟發(fā)展迅速和人民生活質(zhì)量提高，市場對瘦肉型豬的需求增加，因此在養(yǎng)豬生產(chǎn)中追求高產(chǎn)出和高收益，這使得國外豬種被大面積引進與河南地方豬種進行雜交，雖然提高了本地豬種的生產(chǎn)性能，但卻導(dǎo)致純種豬的數(shù)量急劇減少。而藏豬因為國外豬種的引進，更是面臨種群滅絕的危險。在我國豬肉產(chǎn)量已成為世界第一的今天，我國養(yǎng)豬生產(chǎn)也應(yīng)向優(yōu)質(zhì)化和可持續(xù)化發(fā)展。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，基于測序數(shù)據(jù)進行選擇信號分析可以快速準(zhǔn)確地篩選出受選擇區(qū)域并定位到相關(guān)候選基因。通過對候選基因的功能注釋，利用基因敲除、敲低或過表達等方式驗證基因的功能，能夠篩選確定關(guān)鍵功能基因，以應(yīng)用于遺傳改良或新品種培育的實踐中。目前對多個群體進行選擇信號檢測常用的方法是群體分化指數(shù)（Fixation indices，F(xiàn)st）方法。群體遺傳分化是指物種群體間存在明顯的等位基因頻率差異，通常遺傳漂變和選擇過程均可造成群體間的遺傳分化。Fst 是檢測群體間遺傳分化的重要指標(biāo)之一，而對全基因組范圍內(nèi)的單個位點估算Fst 值，就能對每個位點分析其分化程度，最終實現(xiàn)選擇信號檢測。通過選擇信號分析鑒定豬重要經(jīng)濟性狀候選基因已有諸多報道，陶偉等鑒定出5 個影響豬肉滴水損失的候選基因。馮雪燕等挖掘出91 個與海南豬重要經(jīng)濟性狀相關(guān)的候選基因。李景研究過藏豬高原適應(yīng)性選擇信號，而河南地方豬這方面的研究較少。

本研究利用全基因組重測序數(shù)據(jù)從基因組范圍內(nèi)對河南地方豬、藏豬和野豬進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析和選擇信號分析，并對河南地方豬和藏豬進行基因流分析，旨在探究河南地方豬和藏豬的遺傳分化和基因交流情況，發(fā)掘與重要經(jīng)濟性狀相關(guān)的候選基因，為河南地方豬和藏豬的種質(zhì)資源保護和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究從NCBI 的Sequnence Read Archive（SRA）數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）中下載了66 頭豬的全基因組重測序數(shù)據(jù)。其中，河南地方豬包括淮南豬（HN）9 頭、確山黑豬（QS）10 頭和南陽黑豬（NY）10 頭，共29 頭豬，藏豬（ZZ）共28 頭，野豬包括河南野豬（WHN）6 頭和中國野豬（WB）3 頭，共9 頭豬。

1.2 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制 對全基因組重測序數(shù)據(jù)按照移除性染色體、保留常染色體、次要等位基因頻率<0.01 且檢出率>0.99 的標(biāo)準(zhǔn)進行過濾后，共獲得6 884 804 個常染色體雙等位基因SNP 用于后續(xù)分析。

1.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 使用PLINK（https://www.cog-genomics.org/plink2/）進行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）。并使用R（https://www.rproject.org/）繪制每個個體的散點分布圖。使用Admix ture（http://dalexander.github.io/admixture/）進行群體結(jié)構(gòu)分析，最佳聚類數(shù)（K）由交叉驗證誤差率的方法確定。使用IQ-TREE（http://www.iqtree.org/）生成系統(tǒng)進化樹；并使用R 的ggtree（https://guangchuangyu.github.io/software/ggtree/）繪制系統(tǒng)進化樹。

1.4 選擇信號分析 使用Vcftools（http://vcftools.sourc eforge.net/index.html）分別對河南地方豬、藏豬和野豬進行Fst 分析（窗口大小為20 000，步長為5 000），計算公式如下：

其中，MSG 是未檢測的群體內(nèi)部位點的誤差均方，MSP 是檢測的群體之間位點的均方差，n指校正后群體間的平均樣本大小。

1.5 候選基因的檢測和注釋 以Fst 分析得到的前1%窗口作為各品種受選擇區(qū)域，將受選擇區(qū)域內(nèi)的基因使用Enesmbl 數(shù)據(jù)庫（https://asia.ensembl.org/index.html）的BioMart 功能進行基因功能注釋，并利用GeneCards 網(wǎng)站（https://www.genecards.org/）和閱讀文獻查詢?nèi)炕虻墓δ堋?/p>

1.6 候選基因的富集分析 利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（http://david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp）對基因進行GO（Gene Ontology）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclo pedia of Genes and Genomes）富集分析，并分別生成富集分析圖。

1.7 基因流分析 使用TreeMix 軟件推斷分化和混合情況。使用R 的OptM（https://www.rdocumentation.org/packages/OptM/versions/0.1.6）判斷最優(yōu)m 值，使用最優(yōu)m 值進行TreeMix 分析，并繪制最大似然樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 對6 個豬種進行PCA 分析、系統(tǒng)進化樹分析和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。PCA 結(jié)果顯示，野豬在右下角，與其他豬種距離較遠(yuǎn)；淮南豬、確山黑豬和南陽黑豬聚在一起，藏豬的分布比較分散，主要聚集成了3 個部分（圖1）。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示，3 個河南地方豬種在同一個大分支上，確山黑豬和南陽黑豬在一個分支上，南陽黑豬在另一個分支上；藏豬在一個大分支上，并分出3 個分支；中國野豬和河南野豬在一個大分支上，有2 個河南野豬個體并未和其他個體劃分在同一個分支上（圖2）。群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，當(dāng)K 為2 時，交叉驗證誤差最?。▓D3A），所以K 的最佳估計數(shù)為2。當(dāng)K=2 時，淮南豬、南陽黑豬、確山黑豬和藏豬、野豬、河南野豬很明顯的分離出來；當(dāng)K=3 時，淮南豬被分離出來，藏豬被分成2 個亞群；當(dāng)K=4 時，確山黑豬、藏豬和野豬被分離出來；當(dāng)K=5 時，南陽黑豬和淮南豬，野豬和河南野豬仍然混在一起；當(dāng)K=6 時，南陽黑豬被分離出來（圖3B）。

圖1 PCA 分析結(jié)果

圖2 系統(tǒng)進化樹

圖3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.2 Fst 分析結(jié)果 使用Vcftools 對河南本地豬、藏豬和野豬進行Fst 分析。結(jié)果顯示：河南地方豬和藏豬之間的前1% 窗口有446 個受選擇區(qū)域（圖4A），其中注釋出的基因有134 個；河南地方豬和野豬之間前1%窗口有446 個受選擇區(qū)域（圖4B），注釋出的基因有179 個；藏豬和野豬前1%窗口有446 個受選擇區(qū)域（圖4C），注釋出的基因有148 個。3 次比對獲得的全部基因共有369 個。

圖4 Fst 曼哈頓圖

2.3 功能富集分析 將3 次比對獲得的全部369 個基因進行GO 富集分析和KEGG 富集分析。GO 富集分析顯示：基因顯著富集于細(xì)胞核（Nucleus）、胞質(zhì)溶膠（Cytosol）、RNA 聚合酶II 對轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控（Negative Regulation of Transcription by RNA Polymerase II）和凋亡過程的正向調(diào)控（Positive Regulation of Apoptotic Process）等通路（圖5）；KEGG 富集分析顯示：基因顯著富集于磷酸肌醇代謝（Inositol Phosphate Metabolism）、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)（Phosphatidylinositol Signaling System）、內(nèi)分泌和其他因子調(diào)節(jié)的鈣重吸收（Endocrine and Other Factor-Regulated Calcium Reabsorption）、代謝途徑（Metabolic Pathways）和內(nèi)吞作用（Endocyt osis）等通路（圖6）。

圖5 GO 富集分析圖

圖6 KEGG 富集分析圖

2.4 基因流分析 基因流指一個物種的一個種群向另一個種群的基因轉(zhuǎn)移，利用OptM 判斷最優(yōu)m 值為2，以m=2繪制最大似然樹（圖7）?；蛄鞣治鼋Y(jié)果顯示：藏豬和確山黑豬有少量的基因轉(zhuǎn)移，即發(fā)生了基因交流情況。

圖7 基因滲入圖

3 討 論

3.1 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析與基因流分析 遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示，3 個河南地方豬的親緣關(guān)系很近，2 個主成分并不能將3 個豬群體分離，3 個群體在進化樹上的距離也很近，在同一個分支上。藏豬在PCA 分析中群體分布比較散亂，主要形成了3 個聚集；藏豬群體內(nèi)親緣關(guān)系較低，在進化樹上也分成了3 個分支，可能是由于取材的藏豬來自不同的地區(qū)，分布區(qū)域較為廣泛；遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示藏豬內(nèi)部存在外源滲入和結(jié)構(gòu)分化現(xiàn)象，基因流分析也顯示藏豬與確山黑豬存在基因交流情況，這可能是藏豬與確山黑豬進行過雜交改良所導(dǎo)致的。

3.2 選擇信號分析 基于Fst 方法對6 個豬種進行選擇信號分析，并對前1%的窗口進行基因功能注釋，共注釋出369 個基因，這些基因富集在GO 的1 401 個條目上和KEGG 的225 個條目上。

本研究發(fā)現(xiàn)和在細(xì)胞的生長和存活過程中發(fā)揮作用；和在細(xì)胞的增殖和分化中發(fā)揮作用。這些基因作用于細(xì)胞的生長、增殖和分化過程，可能會影響豬的生長發(fā)育。能介導(dǎo)音猬因子（SHH）信號，通過其在SHH 信號傳導(dǎo)中的作用在細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮作用。則是胞質(zhì)分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子?？梢酝ㄟ^TRIP4 去甲基化調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)核受體的反式激活，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化。能通過調(diào)節(jié)G1/S 期轉(zhuǎn)換在細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用。

、、、和在精子生成中發(fā)揮作用。和在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮作用，和在精卵結(jié)合中發(fā)揮作用?？赡軈⑴c卵子和早期胚胎中的細(xì)胞骨架重組。是卵裂溝的正常形成和雌性生殖細(xì)胞減數(shù)分裂過程中極體擠出所必需的?？赡茉诰雍吐涯讣?xì)胞的分化中起作用。以上基因可能會影響豬的繁殖性能。

、和在心臟發(fā)育和血管生成中發(fā)揮作用，而、和可以調(diào)控缺氧中的基因表達。這些基因可能與藏豬心血管器官發(fā)達、能適應(yīng)高原環(huán)境有關(guān)。可作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)參與炎癥反應(yīng)、血管生成、脂肪生成和細(xì)胞凋亡的多個基因的表達。是抑制缺氧中的基因表達的關(guān)鍵因子，通過直接結(jié)合其啟動子區(qū)域上的RE1/NRSE 位點來抑制缺氧中的基因表達。是參與誘導(dǎo)氧調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄因子。在對低氧張力的適應(yīng)性反應(yīng)中充當(dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑，作為缺氧誘導(dǎo)基因表達的調(diào)節(jié)劑。

本研究發(fā)現(xiàn)3 個基因與脂肪的合成與代謝有關(guān)，可能與豬的低瘦肉率有關(guān)?？梢源碳ぐ咨窘M織（WAT）中的脂肪生成。能通過結(jié)合長鏈脂肪酸并促進其轉(zhuǎn)運到細(xì)胞中從而參與肌肉脂質(zhì)利用、脂肪能量儲存和腸道脂肪吸收。而在長鏈脂肪酸及其?；o酶A 酯的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運中起作用。

共6 個基因與免疫功能相關(guān)，可能與河南地方豬和藏豬的高抗病性有關(guān)。是適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，對于維持調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞功能和B 細(xì)胞成熟至關(guān)重要。是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，在免疫過程中起重要作用。與kappa 免疫球蛋白基因增強子中的kappa-E2 位點結(jié)合。能激活免疫球蛋白基因表達。

4 結(jié) 論

本研究通過群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，3 個河南地方豬品種的親緣關(guān)系近，河南野豬因為地理位置的原因與河南地方豬的親緣關(guān)系相較中國野豬更近。利用6個豬品種的全基因組重測序數(shù)據(jù)，應(yīng)用Fst 方法檢測豬基因組的選擇信號，共篩選出47 個候選基因，其中14個基因與細(xì)胞生長、增殖和分化有關(guān)，3 個基因與心血管發(fā)育有關(guān)，3 個基因與氧調(diào)節(jié)有關(guān)，18 個基因與繁殖性能有關(guān)，3 個基因與脂肪的合成與代謝有關(guān)。此外基因流分析顯示，藏豬與確山黑豬之間有基因交流。這些研究結(jié)果為河南地方豬和藏豬的種質(zhì)資源保護與利用提供了參考。