張 晨，王明宇，葉建偉，李新建，韓雪蕾，王克君，呂 剛，李改英，任廣志，李 明，喬瑞敏

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450000)

確山黑豬具有適應(yīng)性強(qiáng)，肉質(zhì)細(xì)嫩、色暗紅、富含大理石紋等優(yōu)良特征。確山黑豬分布于確山周邊，分布面積較廣，數(shù)量較多，但因其生長(zhǎng)速度慢、瘦肉率低，在1998年前后確山黑豬數(shù)量急劇下降[1]。線粒體DNA是高等動(dòng)物體內(nèi)的母系遺傳物質(zhì)，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、保守型強(qiáng)、進(jìn)化速率快等特點(diǎn)，是研究遺傳進(jìn)化的理想材料[2-3]。D-loop區(qū)是線粒體DNA上的一段非編碼區(qū)，受進(jìn)化壓力小[4-5]，遺傳變異程度高且進(jìn)化速率快，是其他區(qū)段的5倍[5-6]，常被用來(lái)開(kāi)展遺傳進(jìn)化研究。本研究通過(guò)擴(kuò)增確山黑豬保種場(chǎng)內(nèi)現(xiàn)存全部38頭公豬個(gè)體的線粒體D-loop區(qū)段，分析該區(qū)段內(nèi)的遺傳多態(tài)性，評(píng)估確山黑豬的遺傳多樣性現(xiàn)狀和品種內(nèi)個(gè)體間的親緣關(guān)系，旨在為后續(xù)有效保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用確山黑豬提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及基因組DNA提取

本研究中的確山黑豬來(lái)自河南省駐馬店確山黑豬保種場(chǎng)，采集場(chǎng)內(nèi)全部38頭公豬個(gè)體的新鮮耳組織樣品，置于1 mL 75%乙醇中保存，采用酚-氯仿法提取DNA[7]。利用Nanodrop 2000和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量。

1.2 PCR擴(kuò)增和測(cè)序

PCR擴(kuò)增的上游引物為：5'-AGGAGACTAACTCCGCCAT-3'，下游引物為： 5'-CGCGGATACTTGCATGTGT-3'[8]，引物由南京金斯瑞生物有限公司合成。采用25 μL的反應(yīng)體系：包括40 ng DNA，12.5 μL 2×ES Taq MasterMix(康為世紀(jì) CW2214M)，10 pmol正反向引物，8.5 μL水。擴(kuò)增條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；51.3 ℃，30 s；72 ℃，50 s，25個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，檢測(cè)合格后送往南京金斯瑞生物有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 序列比對(duì)和進(jìn)化分析

利用DNASTAR 7.1.0軟件中的SeqMan程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較。將確山黑豬D-loop區(qū)序列與NCBI上公布的長(zhǎng)白豬(NC_000845.1)的D-loop區(qū)段參考序列進(jìn)行比對(duì)，比較二者之間的核苷酸序列差異，獲得確山黑豬D-loop區(qū)的核苷酸變異情況。從NCBI上下載杜洛克豬(MF183225.1)、大白豬(KF752550.1)、萊蕪黑豬 ( KJ720205.1)、二花臉豬(AF486861.1)的D-loop區(qū)序列。河南地方豬南陽(yáng)黑豬、淮南黑豬、豫西黑豬的線粒體D-loop區(qū)序列來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室的測(cè)序結(jié)果。利用DnaSP 5.0構(gòu)建單倍型，用MEGA 7.0軟件的最大似然法，對(duì)38頭確山黑豬公豬個(gè)體的線粒體D-loop區(qū)及上述序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物檢測(cè)及測(cè)序

確山黑豬線粒體D-loop區(qū)的PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1，產(chǎn)物大小為1 175 bp。經(jīng)過(guò)Sanger雙向測(cè)序后，選取D-loop區(qū)內(nèi)拷貝數(shù)變異(repeat_region)之前測(cè)序質(zhì)量較好的630 bp片段，使用SeqMan對(duì)38頭確山公豬的76條序列和參考序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在確山黑豬中共檢測(cè)到17個(gè)核苷酸變異(見(jiàn)表1)。

圖1 確山黑豬線粒體D-loop區(qū)PCR產(chǎn)物電泳圖1-9、11-17．確山黑豬；10.陰性對(duì)照；M.2000 bp DNA markerFig.1 Electrophoresis of PCR products of mitochondriaD-loop region of Queshan Black pigs1-9，11-17．Queshan Black pig; 10. negative control;M.2000 bp DNA marker

表1 確山黑豬D-loop區(qū)內(nèi)的單核苷酸突變及單倍型分類(lèi)Table 1 Single nucleotide polymorphisms and haplotypes of D-loop region of Queshan Black pigs

注：109-575表示17個(gè)核苷酸突變的位置；·表示與Hap 1相同堿基；-表示堿基缺失。

Note:109-575 represents the positions of 17 nucleotide mutations; · represents the same base as Hap 1; - represents base deletion.

2.2 單倍型及進(jìn)化樹(shù)分析

由表1知，38頭確山黑豬分屬于9種單倍型，依據(jù)單倍型內(nèi)個(gè)體數(shù)的多少依次命名為Hap 1～ Hap 9。Hap1為優(yōu)勢(shì)單倍型，出現(xiàn)在21個(gè)個(gè)體中，Hap 2 ～ Hap 9依次存在于5、5、2、1、1、1、1、1個(gè)個(gè)體中。

由圖2可見(jiàn)，確山黑豬相對(duì)聚為一簇，品種內(nèi)的9種單倍型聚為7支，其中，Hap1和Hap4與其他個(gè)體關(guān)系稍遠(yuǎn)。增加分析河南省其它地方豬種，結(jié)果并沒(méi)有增加D-loop區(qū)的單倍型數(shù)目。其中，南陽(yáng)黑豬的單倍型同為Hap1，豫西黑豬、淮南黑豬的單倍型同為Hap4。確山黑豬與西方商業(yè)豬種總體的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與中國(guó)地方豬關(guān)系更近。確山黑豬與大白豬的關(guān)系稍近于杜洛克豬和長(zhǎng)白豬；相比于萊蕪黑豬，確山黑豬與與二花臉豬的親緣關(guān)系更近。

圖2 確山黑豬和西方商業(yè)豬種以及中國(guó)地方豬種D-loop區(qū)單倍型NJ進(jìn)化樹(shù)Fig.2 The neighbor-joining tree of haplotypes of D-Loop region in Queshan Black pigs and westerncommercial pigs and Chinese indigenous pigs

3 討 論

河南省確山縣大王山確山黑豬保種場(chǎng)內(nèi)采用隨機(jī)交配，場(chǎng)內(nèi)放養(yǎng)、圈養(yǎng)相結(jié)合的飼養(yǎng)管理方式，為了更好地保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用確山黑豬，明確品種內(nèi)不同個(gè)體的血緣關(guān)系是首要任務(wù)。本研究首次對(duì)確山黑豬開(kāi)展遺傳評(píng)估工作，通過(guò)測(cè)定現(xiàn)存全部38頭公豬個(gè)體的線粒體D-loop區(qū)序列，分析其遺傳多態(tài)性和個(gè)體間的親緣關(guān)系。結(jié)果顯示，與參考序列相比，確山黑豬存在17個(gè)核苷酸變異，個(gè)體間存在一定差異，17個(gè)突變分屬于9種單倍型，說(shuō)明確山黑豬的遺傳多態(tài)性較為豐富，也在一定程度上提示確山黑豬的保種壓力不大，可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

比較確山黑豬、與杜洛克豬、長(zhǎng)白豬、大白豬及鄰近地區(qū)豬種的D-loop區(qū)序列，為確定和利用確山黑豬的母系血緣提供參考。利用單倍型構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)顯示，確山黑豬母系血緣與西方品種距離較遠(yuǎn)，確山黑豬與大多數(shù)中國(guó)地方豬一樣，與西方豬種相比單獨(dú)聚為1類(lèi)；品種內(nèi)9種單倍型聚為7個(gè)分支，反映了確山黑豬品種內(nèi)遺傳多樣性較為豐富，為當(dāng)前的育種工作和生產(chǎn)服務(wù)提供了有效的分子水平的理論參考，為下一步的開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。鑒于D-loop區(qū)序列較短，有必要進(jìn)一步對(duì)確山黑豬的全線粒體基因組和核基因組開(kāi)展遺傳評(píng)估。