謝運(yùn)法，許春榮，胡傳活*，陳志英，馮 妮，劉德玉，唐榮福，李美珍，唐胤晟，汪燕玲，黃明光

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西畜禽品種改良站，廣西南寧 530001；3.廣西畜牧研究所，廣西南寧 530001）

公豬精液保存主要有常溫保存（15～17℃）、低溫保存（4℃）、超低溫保存（-196℃），其中，常溫保存因?yàn)榇x快，有害代謝產(chǎn)物堆積，內(nèi)源性細(xì)菌容易滋生等諸多因素，不利于精液的長(zhǎng)期保存，又因豬精子質(zhì)膜富含不飽和脂肪酸和特殊的膜結(jié)構(gòu)，對(duì)冷刺激敏感；超低溫保存目前無(wú)法用于規(guī)?；a(chǎn)，而低溫條件下精子處于半休眠狀態(tài)，活性氧（ROS）和有害代謝產(chǎn)物減少，內(nèi)源性細(xì)菌滋生受到抑制，這些條件使得低溫保存研究具有較高的實(shí)際意義。

精子在陰道要經(jīng)過(guò)一系列變化才能與卵子結(jié)合形成受精卵，而此變化為獲能。Green 等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)精子溫度降低至5～15℃時(shí)，會(huì)發(fā)生類(lèi)似于獲能反應(yīng)的“獲能樣”變化，而精子發(fā)生獲能是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，與ROS、Ca、HCO、pH等諸多因素有關(guān)，其中Ca和ROS 濃度變化是引起精子發(fā)生獲能的關(guān)鍵指標(biāo)。

五味子乙素（SchB）作為一種天然的抗氧化劑，不僅有增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力的功能，還具有抑制細(xì)胞內(nèi)Ca濃度的作用。本實(shí)驗(yàn)研究在冷藏基礎(chǔ)液中添加SchB 對(duì)4℃保存后豬精子質(zhì)量及獲能狀態(tài)的影響，為豬精液低溫保存技術(shù)的完善提供一定的理論和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 豬精液采集 采集廣西科達(dá)畜禽改良有限責(zé)任公司8 頭體況相近杜洛克種公豬精液，各取25 mL 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與溶液配制 SchB（有效含量≥98%）購(gòu)自維克奇生物科技公司；總抗氧化能力（T-AOC）、考馬斯藍(lán)R250、FLuo-3AM 鈣離子、乳酸、DNA 損傷（AO）、線粒體膜電位（MMP）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自索萊寶生物公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純。SchB 以二甲基亞砜（DMSO）為稀釋液，稀釋后4℃保存。

精子冷藏基礎(chǔ)液：首先用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)量：葡萄糖3 g、蔗糖4 g 置于事先消毒的燒杯中，加入適量的純化水水浴加熱溶解。取出冷卻至室溫，準(zhǔn)確稱(chēng)取青霉素0.06 g、慶大霉素0.048 g 加到廣口瓶中，待全部溶解后用0.22 μm 過(guò)濾器過(guò)濾，加入經(jīng)過(guò)12 000 r/min離心20 min 的卵黃上清液20 mL，定容至100 mL。4℃保存，并在12 h 內(nèi)使用。冷藏基礎(chǔ)液配制參照文獻(xiàn)。

1.3 主要儀器 液晶顯示器顯微鏡購(gòu)自深圳泰宇星光電儀器有限公司；電子車(chē)載冰箱、電子冷暖箱購(gòu)自北京福意聯(lián)電器有限公司；冰箱購(gòu)自河南新飛電器有限公司；恒溫水浴鍋購(gòu)自上海精宏有限公司；低溫超速離心儀購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士TCAN INFIEF PLEX 公司；精子分析儀購(gòu)自法國(guó)卡蘇公司。

1.4 精液冷藏 精液稀釋后，23～25℃條件下暗處?kù)o置平衡0.5 h，數(shù)層紗布包裹后放入電子冷暖箱中于17℃條件下平衡2 h，最后再次包裹數(shù)層紗布放入4℃冰箱中保存，并且每隔6 h 輕輕晃動(dòng)1 次。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)在冷藏基礎(chǔ)液中添加不同濃度的SchB 將精液分為6 組，分別為0、2.5、5、10、20、40 μmol/L 組，0 μmol/L 組為對(duì)照組，冷藏1 d 后對(duì)精子活力、頂體完整率、質(zhì)膜完整率、畸形率、平均運(yùn)動(dòng)速率、擺動(dòng)性、DNA 損傷、MMP、T-AOC、Ca含量、乳酸含量進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 精子質(zhì)量檢測(cè)

1.6.1 精子活力的檢測(cè) 按照文獻(xiàn)所述方法，取20 μL冷藏后精液滴于37℃恒溫板上預(yù)熱的載玻片上，400 倍鏡下觀察精子活力（以精子作直線運(yùn)動(dòng)百分比為標(biāo)準(zhǔn)），每組取3 個(gè)視野，重復(fù)3 次。

1.6.2 精子頂體完整率的檢測(cè) 用考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)精子頂體的完整性，取100 μL 精液于3.7%多聚甲醛中固定10 min，PBS 洗滌1 次，加100 μL 的PBS 制成懸液，混勻后取10 μL 制成涂片，自然晾干。把風(fēng)干后的載玻片于裝有考馬斯亮藍(lán)的染色缸中染色，自來(lái)水輕輕沖洗，置于染色架上自然晾干。在400 倍光學(xué)顯微鏡下觀察頂體完整性（頂體完整的精子頭部染成均勻的藍(lán)色，表面光滑，輪廓清晰），每次至少計(jì)數(shù)200 個(gè)精子，重復(fù)3 次。

1.6.3 精子質(zhì)膜完整率的檢測(cè) 取100 μL 冷藏后精液于果糖-檸檬酸鈉低滲溶液中，調(diào)整精子密度到1×10～2×10個(gè)/mL，37℃條件下孵育30 min，取20 μL 混合液于載玻片上，蓋上蓋玻片，于400 倍光學(xué)顯微鏡下觀察精子彎尾率，重復(fù)3 次。

1.6.4 精子畸形率、平均運(yùn)動(dòng)速率、擺動(dòng)性的檢測(cè) 取20 μL 精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，用精子分析儀對(duì)冷藏后精子畸形率、平均運(yùn)動(dòng)速率、擺動(dòng)性進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3 次。

1.6.5 精子MMP 的檢測(cè) 調(diào)整精子密度到1×10～2×10個(gè)/mL，于1 mL 的PBS 中900 r/min 離心10 min，棄上清，重復(fù)3 次。根據(jù)線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）進(jìn)行操作，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各組熒光值，重復(fù)3 次。

1.6.6 精子DNA 損傷的檢測(cè) 根據(jù)檢測(cè)說(shuō)明書(shū)在避光的條件下進(jìn)行操作，染色涂片后在400 倍熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察（染成黃綠色熒光為正常精子的細(xì)胞核，綠色顆粒狀則為DNA 損傷細(xì)胞核），至少計(jì)數(shù)200 個(gè)精子，重復(fù)3 次。

1.6.7 精子T-AOC 的檢測(cè) 取冷藏后精液用PBS 洗滌3次后收集精子沉淀，放于冰盒之中，用超聲破碎精子，然后于低溫離心機(jī)上，10 000 r/min 離心5 min，取上清檢測(cè)蛋白濃度，按照檢測(cè)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)精子T-AOC。

1.6.8 精子冷藏后Ca的檢測(cè) 分別取1 mL 各組精液，用PBS 緩沖液900 r/min 離心10 min，棄上清，重復(fù)3 次。根據(jù)索萊寶Ca檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)各組熒光值，重復(fù)3 次。

1.6.9 精子獲能水平的檢測(cè) 根據(jù)參考文獻(xiàn)的試驗(yàn)結(jié)論，精子獲能的主要產(chǎn)物是乳酸，乳酸含量越多精子獲能的程度越大，據(jù)此設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)。取冷藏后精子用PBS洗滌3 次后收集精子沉淀，放于冰盒之中，用超聲破碎精子，然后于低溫離心機(jī)上8 000 r/min 離心10 min，取上清檢測(cè)蛋白濃度，根據(jù)乳酸試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各組數(shù)值，重復(fù)3 次。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Excel 2007、SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Graphpad Prism 5.0 軟件繪圖，采用檢驗(yàn)和單因素方差分析處理數(shù)據(jù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，<0.05 表示差異顯著，>0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SchB 對(duì)冷藏后精子活力、頂體完整率、質(zhì)膜完整率的影響 由表1、圖1 可知，10 μmol/L SchB 組的精子活力顯著高于其他組（<0.05），2.5、5 μmol/L SchB組的頂體完整率和質(zhì)膜完整率高于對(duì)照組和40 μmol/L組（<0.05），低于10 μmol/L 組（<0.05）。

表1 SchB 對(duì)冷藏后精子活力、頂體完整率、質(zhì)膜完整率影響的影響

圖1 SchB 對(duì)冷藏后精子質(zhì)膜、頂體完整率的影響

2.2 SchB 對(duì)冷藏后精子畸形率、平均運(yùn)動(dòng)速率、擺動(dòng)性的影響 由表2 可知，5 μmol/L SchB 組的精子畸形率低于對(duì)照組和2.5、20、40 μmol/L SchB 組（<0.05），高于10 μmol/L SchB 組（<0.05）。5、10 μmol/L SchB組的精子平均運(yùn)動(dòng)速率高于對(duì)照組、2.5、20、40 μmol/L SchB 組（<0.05）。10 μmol/L SchB 組精子擺動(dòng)性顯著高于其他組（<0.05）。

表2 SchB 對(duì)冷藏后精子畸形率、平均運(yùn)動(dòng)速率、擺動(dòng)性的影響

2.3 SchB 對(duì)冷藏后精子MMP、T-AOC、DNA 損傷的影響 由表3 和圖2 可知，對(duì)照組、20、40 μmol/L SchB組MMP 高于2.5、5 μmol/L SchB 組（<0.05），但低于10 μmol/L SchB 組（<0.05）。5 μmol/L SchB 組的T-AOC 高于對(duì)照組、2.5、20、40 μmol/L SchB 組（<0.05），低 于10 μmol/L SchB 組（<0.05）。在SchB 濃度達(dá)到10 μmol/L 前，冷藏后精子DNA 損傷率隨SchB 濃度升高而降低，當(dāng)SchB 濃度到達(dá)5 μmol/L時(shí)達(dá)到顯著差異，當(dāng)濃度到達(dá)10 μmol/L 時(shí)差異最為顯著（<0.05）。

表3 SchB 對(duì)冷藏后精子MMP、T-AOC、DNA 損傷的影響

圖2 SchB 對(duì)冷藏后精子DNA 損傷的檢測(cè)

2.4 SchB 對(duì)冷藏后精子Ca、乳酸含量的影響 由表4可知，冷藏后精子內(nèi)Ca濃度呈現(xiàn)隨SchB 的濃度升高而降低的趨勢(shì)，且SchB 濃度達(dá)到5 μmol/L 時(shí)與對(duì)照組比較Ca濃度降低（<0.05）。

表4 SchB 對(duì)冷藏后精子Ca2+濃度、乳酸含量的影響

3 討 論

3.1 SchB 對(duì)冷藏后豬精子表觀指標(biāo)的影響 在豬精液保存過(guò)程中，抑制精子過(guò)度氧化一直都是豬精子冷藏研究的熱點(diǎn)，五味子乙素作為一種強(qiáng)有力的抗氧化劑在大鼠心臟、肝臟等器官保存中取得了良好的成效，但是在豬精液的冷藏中尚無(wú)人研究。在精子的保存過(guò)程中精子的活力、頂體完整率、質(zhì)膜完整率、畸形率、平均運(yùn)動(dòng)速率、擺動(dòng)性、MMP、DNA 損傷、T-AOC 是評(píng)定精子質(zhì)量的重要指標(biāo)。Hirano 等研究發(fā)現(xiàn)，精子的直線速率和曲線速率與其受精率呈正相關(guān)，而精子活力又與精子的直線速率和曲線速率呈正相關(guān)。He 等研究發(fā)現(xiàn)，精子質(zhì)膜的完整性對(duì)精子的新陳代謝、受精、獲能都有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在精液冷藏基礎(chǔ)液中添加適量的SchB 對(duì)精子的活力、頂體完整率、質(zhì)膜完整率、平均運(yùn)動(dòng)速率、擺動(dòng)性、MMP 都起到積極作用，且最適濃度10 μmol/L，但過(guò)量添加會(huì)降低公豬精液品質(zhì)。

活性氧（ROS）是精子氧化過(guò)程中的重要產(chǎn)物，ROS 含量過(guò)多容易導(dǎo)致精子DNA 損傷，畸形率上升，活力下降從而影響動(dòng)物繁殖能力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在冷藏基礎(chǔ)液中添加適量的SchB 可以提高精子的總抗氧化能力，降低精子DNA 的損傷以及畸形精子的產(chǎn)生，當(dāng)添加量為10 μmol/L 時(shí)效果最為顯著，但添加過(guò)量時(shí)會(huì)起到相反的作用。

3.2 SchB 對(duì)冷藏后豬精子獲能情況的影響 研究發(fā)現(xiàn)，Ca通過(guò)參與環(huán)磷酸腺苷（cAMP）-蛋白激酶A（PKA）的信號(hào)通路引起精子獲能，其作用機(jī)理為Ca達(dá)到閾值后激活可溶性腺苷酸環(huán)化酶（sAC）合成cAMP，cAMP 濃度達(dá)到閾值后便會(huì)激活PKA，最終依靠PKA 的活性來(lái)調(diào)控精子獲能情況，精子獲能后會(huì)出現(xiàn)超活化現(xiàn)象，其膜的通透性發(fā)生變化，能量代謝速率以及運(yùn)動(dòng)速度都會(huì)大幅度加強(qiáng)，獲能后的精子無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間保存，因此抑制精子保存過(guò)程中獲能的發(fā)生，也是提高冷藏后精子質(zhì)量的途徑。Carrageta 等研究發(fā)現(xiàn)，精子獲能過(guò)程中能量代謝的主要產(chǎn)物是乳酸，因此精子乳酸含量也是評(píng)定精子獲能情況的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在冷藏基礎(chǔ)液中添加SchB 可以降低精子內(nèi)Ca和乳酸濃度，但是在降低Ca濃度時(shí)最適濃度不是10 μmol/L，很可能的原因是當(dāng)濃度超過(guò)10 μmol/L時(shí)，精子質(zhì)量降低導(dǎo)致所測(cè)得Ca濃度偏低。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在冷藏基礎(chǔ)液中添加10 μmol/L SchB 可以顯著提高冷藏后精子的質(zhì)量，并且可以降低冷藏過(guò)程中精子的被動(dòng)獲能。