盧津侖，盧 旭，程玲華，李 琴，郭 敏，安 磊，田見暉

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

人工輸精技術(shù)（Artificial Insemination，AI）是自20 世紀(jì)30 年代來推動(dòng)生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要技術(shù)。子宮頸輸精（Cervical Artificial Insemination，CAI）也叫常規(guī)輸精，是生豬產(chǎn)業(yè)最常用的輸精程序，其操作簡單，通常每個(gè)輸精劑量為80～100 mL、含20 億～40 億個(gè)精子。近年來，深部輸精作為新的輸精技術(shù)正逐漸取代傳統(tǒng)的子宮頸輸精。根據(jù)輸精部位不同，深部輸精技術(shù)分為子宮頸后輸精技術(shù)（Post-Cervical Artificial Insemination，PCAI）、子宮角輸精技術(shù)（Deep Intrau terine Insemination，DUI）和輸卵管輸精技術(shù)（Intraoviductal Insemination，IOI）。隨著技術(shù)發(fā)展，深部輸精單劑量的有效精子數(shù)可以比常規(guī)輸精減少到1/3～1/2已被廣泛接受。國內(nèi)最常用的深部輸精技術(shù)是子宮頸后深部輸精，通常每個(gè)輸精劑量為40～80 mL、含10 億～20 億精子，輸精時(shí)精液繞過子宮頸屏障，可以到達(dá)更靠近受精部位的輸卵管附近。常規(guī)輸精單劑量精液有效精子數(shù)多，有30%～40%精液在輸精后回流，浪費(fèi)嚴(yán)重。深部輸精所用精液輸精體積少，回流少，提高了母豬的分娩率和產(chǎn)仔數(shù)。深部輸精可以通過減少輸精劑量，增加公豬每次射出精液所能制備的輸精頭份，從而提高優(yōu)良公豬的利用率，加快豬群的遺傳改良進(jìn)展，減少公豬飼養(yǎng)規(guī)模和成本。雖然深部輸精技術(shù)已得到廣泛研究和應(yīng)用，但保證母豬繁殖性能的最低輸精劑量及相應(yīng)的保存密度和體積、不同品種或胎次應(yīng)用深部輸精時(shí)的內(nèi)管插入深度仍待優(yōu)化和研究。本研究旨在找到不影響精液保存效果和母豬繁殖性能的最低輸精劑量及相應(yīng)保存參數(shù)，并研究不同品種或胎次深部輸精內(nèi)管插入深度差異以及深部輸精技術(shù)的推廣應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)一探究有效精子數(shù)或輸精體積對精液不同保存時(shí)間精子活率的影響。檢測12 組不同有效精子數(shù)（30 億、15 億、7.5 億、5 億）和輸精體積（80、60、40 mL）的精液在17℃恒溫保存12、24、48、72 h后的精子活率。實(shí)驗(yàn)二和實(shí)驗(yàn)三在河北省石家莊市雙鴿美丹畜牧科技公司豬場開展，選擇體況良好的1 028 頭經(jīng)產(chǎn)母豬用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)二探究不同低劑量精液深部輸精對經(jīng)產(chǎn)母豬繁殖性能的影響。將500 頭健康經(jīng)產(chǎn)母豬隨機(jī)分為5 組。常規(guī)輸精30 億/80 mL 作為對照組，深部輸精按15 億/80 mL、15 億/40 mL、7.5 億/40 mL、5 億/40 mL 的輸精劑量分為4 組。5 組母豬的胎次分別為3.54、3.34、3.46、3.81、3.82（>0.05）。母豬斷奶后適時(shí)發(fā)情鑒定，2 次輸精，跟蹤記錄每頭母豬的發(fā)情、妊娠、分娩情況、產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)和健仔數(shù)等數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)三測量統(tǒng)計(jì)不同品種（長白母豬24 頭、二元母豬169 頭和大白母豬50 頭）和不同胎次（3 胎以上80 頭和3 胎以下205 頭）母豬的深部輸精內(nèi)管插入深度，探究不同品種或胎次母豬的深部輸精內(nèi)管插入的適宜深度。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及檢測指標(biāo)

1.2.1 精液的采集和稀釋 精液的采集、稀釋和分裝嚴(yán)格按照《豬人工授精技術(shù)規(guī)程》（NY/T636-2002）和《豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術(shù)規(guī)范》（GB/T 25172-2010）進(jìn)行。

1.2.2 精子活率的測定 用清華同方計(jì)算機(jī)精子分析系統(tǒng)（MX 7.5 版）檢測常溫17℃保存12、24、48、72 h后精液樣品的精子活率。用移液槍吸取1 mL 在 17℃恒溫箱中保存的精液，移入到滅菌的1.5 mL 離心管中，于37℃水浴30 s，水浴后搖勻，然后用移液槍吸取5 μL 于預(yù)熱后的37℃載玻片上，蓋上蓋破片，調(diào)節(jié)顯微鏡獲得清晰圖像，分析5 個(gè)視野下的精子活率。精子活率=（直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子/精子總數(shù)）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)9 次。

1.2.3 發(fā)情鑒定和配種 實(shí)驗(yàn)二和實(shí)驗(yàn)三母豬輸精前需要進(jìn)行發(fā)情鑒定。母豬斷奶3～7 d 后每天2 次發(fā)情鑒定，通過公豬試情和人工查情檢測母豬發(fā)情征狀。首次靜立后 8～12 h 進(jìn)行第1 次輸精，間隔12 h 后進(jìn)行第2 次輸精。同一種輸精技術(shù)使用相同的輸精管。常規(guī)輸精組使用一次性經(jīng)產(chǎn)海綿頭輸精管，嚴(yán)格按照《豬人工授精技術(shù)規(guī)范》（NY/T636-2002）進(jìn)行操作。深部輸精組使用一次性深部輸精管，由熟練掌握輸精技術(shù)的2 人（固定）按照深部輸精操作方法對母豬進(jìn)行輸精。

1.2.4 測量深部輸精內(nèi)管插入深度 深部輸精管分為內(nèi)管、外管2 部分。外管長 50 cm，直徑為 0.5 cm，外管前部的泡沫頭直徑為 2 cm，長為 4 cm，泡沫頭包括縱轍與中部的橫轍；內(nèi)管長為 65 cm，直徑為 0.2 cm。內(nèi)管最長可伸出 15 cm。輸精結(jié)束從生殖道移除導(dǎo)管后，測量外管尖端到內(nèi)管尖端距離作為深部輸精內(nèi)管插入深度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)均先用 Excel 進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)，然后用 SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)（Chi-Square）或單因素方差分析（One-Way ANOVA）等顯著性分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量精液在保存不同時(shí)間的精子活率變化 由表1 知，12 組不同劑量的精液隨著保存時(shí)間的延長，精子活率都有下降趨勢（>0.05），在相同時(shí)間點(diǎn)各劑量組精子活率沒有顯著差異。10 億/80 mL 組、7.5億/80 mL 組、15 億/40 mL 組、7.5 億/40 mL 組低劑量精液在保存24 h 后精子活率與保存12 h 無顯著差異，而保存72 h 后精子活率低于保存12 h（<0.05）。

表1 保存12～72 h 后12 種不同劑量精液的精子活率

2.2 不同低劑量精液深部輸精對母豬繁殖性能的影響由表2 可知，低劑量深部輸精4 組的受胎率和分娩率與對照組差異不顯著；15 億/80 mL 組、15 億/40 mL 組的窩均產(chǎn)仔數(shù)和窩均健仔數(shù)與對照組差異不顯著，窩均活仔數(shù)均高于對照組（<0.05）；7.5 億/40 mL 組的窩均活仔數(shù)和窩均健仔數(shù)高于對照組（<0.05），而窩均產(chǎn)仔數(shù)與對照組差異不顯著（>0.05）；與對照組相比，5 億/40 mL 組提高了窩均產(chǎn)仔數(shù)（<0.05），不影響窩均活仔數(shù)和窩均健仔數(shù)（>0.05），該組的受胎率和分娩率最低，達(dá)不到生產(chǎn)要求。綜合來看，深部輸精7.5 億/40 mL 可使母豬獲得較好的繁殖性能。

表2 不同低劑量精液深部輸精對母豬繁殖性能的影響

2.3 不同品種或不同胎次母豬深部輸精內(nèi)管插入深度的變化 由表3 知，大白母豬、二元母豬、長白母豬的平均內(nèi)管插入深度分別為11.47、12.36、12.32 cm。二元母豬與長白母豬平均內(nèi)管插入深度長于大白母豬（<0.05），但二者間差異不顯著。

表3 不同品種母豬的內(nèi)管插入深度

由表4 知，3 胎以下和3 胎以上母豬平均內(nèi)管插入深度分別為 11.64、12.37 cm，3 胎以上母豬內(nèi)管插入深度長于3 胎以下母豬（<0.05），可能是母豬生殖道隨胎次增加而變長。

表4 不同胎次母豬的內(nèi)管插入深度

3 討 論

3.1 精液密度對精子活率的影響 一般認(rèn)為，精子密度顯著影響保存期間的精子運(yùn)動(dòng)性。精子密度太低會使保護(hù)精子的活性物質(zhì)密度下降，損壞精子質(zhì)膜，降低精子壽命。稀釋后的精子質(zhì)量會隨保存時(shí)間延長而逐漸降低。合理的精子密度可以為精子提供合適的保存環(huán)境，可在一定程度上延長精液的保存時(shí)間。稀釋劑可以為精子提供能量，保持穩(wěn)定pH 和滲透壓，防止細(xì)菌過度生長，從而達(dá)到延長保存時(shí)間的效果。即便如此，深部輸精大部分使用的都是保存時(shí)間較短（一般24～48 h）的精液。有研究發(fā)現(xiàn)，深部輸精劑量15 億/45 mL 和子宮頸輸精劑量 27 億/80 mL 的精液保存72 h 后精子質(zhì)量相似。本研究發(fā)現(xiàn)，10 億/80 mL、7.5 億/40 mL 和15 億/40 mL 劑量的精液在常溫保存72 h 后，精子活率顯著低于保存12 h。因此，建議低劑量精液在常溫保存3 d 內(nèi)使用，確保好的輸精效果。

3.2 輸精劑量的有效精子數(shù)和體積對母豬繁殖性能的影響 深部輸精精液有各種有效精子數(shù)（0.1 億～40 億）和輸精體積（10～85 mL）。國內(nèi)報(bào)道，15 億/40 mL、15 億/80 mL、12 億/60 mL 的精液劑量不會降低母豬的繁殖性能。國外報(bào)道，7.5 億～10 億精子數(shù)可以達(dá)到很好的妊娠和產(chǎn)仔效果，但有效精子數(shù)一旦小于5億，就會產(chǎn)生不利的效果。有效精子數(shù)從5 億減少到2.5 億時(shí)，受胎率（85.5% vs 77.1%）明顯下降。輸精體積也有不同的報(bào)道。國內(nèi)關(guān)于深部輸精的大多數(shù)研究認(rèn)為，深部輸精40 mL 的母豬妊娠率、產(chǎn)仔數(shù)低于深部輸精60 mL。付永利等研究認(rèn)為，60 mL 低劑量深部輸精替代80 mL 常規(guī)輸精，可以提高母豬的繁殖性能。輸精后的精液損失很重要，小于40 mL 的輸精劑量存在降低產(chǎn)仔數(shù)的風(fēng)險(xiǎn)。以上研究表明，輸精劑量的有效精子數(shù)和輸精體積的減少有一定限度。本研究中，深部輸精劑量15 億/80 mL、15 億/40 mL、7.5 億/40 mL 可以滿足生產(chǎn)上對受胎率和妊娠率的要求，說明通過深部輸精技術(shù)將低劑量精液直接輸送到子宮體中，可以與常規(guī)輸精30 億/80 mL 的精液劑量達(dá)到同樣的配種效果。本研究結(jié)果證明，深部輸精可以將精液密度降低到7.5 億/40 mL 而不會影響配種效果，還提高了產(chǎn)仔性能；而5 億/40 mL 的低劑量深部輸精沒有達(dá)到理想的受胎率和分娩率，產(chǎn)仔性能較常規(guī)輸精也沒有顯著提高，原因可能是由于精液中有效精子數(shù)少、精子密度太低，不能保證足夠的精子到達(dá)輸卵管與卵子結(jié)合完成受精過程。

3.3 深部輸精內(nèi)管插入深度對母豬繁殖性能的影響 內(nèi)管插入深度是深部輸精技術(shù)研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)問題。輸精內(nèi)管插入深度會影響母豬的繁殖性能。插入過深可能造成單側(cè)受精，從而降低母豬的產(chǎn)仔數(shù)；插入過淺，內(nèi)管頭部沒有到達(dá)子宮體，容易造成精液倒流。崔茂盛等研究表明，10 cm 的內(nèi)管插入深度輸精后精液回流率較高，而12 cm 的內(nèi)管插入深度可以顯著降低深部輸精后精液的回流率。但也有研究表明，10 cm 和15 cm 的深部輸精深度對大白母豬繁殖性能的影響沒有顯著差異。根據(jù)豬生殖道的生理解剖學(xué)特點(diǎn)，大部分豬的子宮頸在13～17 cm，子宮體長5～8 cm。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長白和二元母豬的深部輸精內(nèi)管插入深度顯著長于大白母豬，可能是因?yàn)檫z傳背景不同導(dǎo)致了母豬生殖道的生理結(jié)構(gòu)出現(xiàn)差異，從而造成了深部輸精內(nèi)管插入深度的變化。而宋學(xué)太等研究發(fā)現(xiàn)，10 cm適度深部輸精對杜洛克、長白和大白母豬的受胎率和分娩率沒有顯著影響。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，有待開展更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)研究。

有研究指出，年齡和胎次可決定母豬子宮頸結(jié)構(gòu)的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，3 胎以上的母豬深部輸精內(nèi)管插入深度顯著長于3 胎以下母豬。García-Vázquez 等研究也表明，經(jīng)產(chǎn)母豬深部輸精內(nèi)管插入總深度比后備母豬更長（56.23 cm vs 50.39 cm）。鑒于不同品種和不同胎次深部輸精內(nèi)管插入深度的不同，豬生產(chǎn)過程中不應(yīng)采用單一的深度標(biāo)準(zhǔn)，而應(yīng)根據(jù)母豬的品種、胎次等因素選取具體的輸精操作參數(shù)，保證母豬的繁殖性能?？蓪⒍㈤L白母豬和高胎次母豬內(nèi)管插入長度增加1～2 cm，以保證精液輸送到子宮體中。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，10 億/80 mL 組、7.5 億/40 mL組和15 億/40 mL 組低劑量精液的精子活率在保存72 h后顯著降低，建議低劑量精液在常溫保存3 d 內(nèi)使用；為保證較好的生產(chǎn)效果，應(yīng)用深部輸精時(shí)輸精劑量應(yīng)不低于7.5 億/40 mL；不同品種或胎次深部輸精內(nèi)管插入深度存在顯著差異，在實(shí)際生產(chǎn)中二元、長白母豬和高胎次母豬的內(nèi)管插入深度應(yīng)適當(dāng)增加1～2 cm。