馬 紅，范文博，汪 亮，付 博，王 芳，劉 娣

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150086）

民豬具有優(yōu)秀的抗寒能力，但民豬的抗寒機(jī)制至今仍不清楚。脂肪組織是哺乳動(dòng)物在低溫環(huán)境下維持體溫恒定的重要組織。脂肪細(xì)胞分為白色脂肪細(xì)胞、棕色脂肪細(xì)胞和米色脂肪細(xì)胞3 類。其中白色脂肪細(xì)胞主要功能為保存能量，棕色脂肪和米色脂肪細(xì)胞中含有較多的線粒體，可以通過(guò)解偶聯(lián)作用釋放熱量維持體溫。白色脂肪細(xì)胞在特定條件下可轉(zhuǎn)化為米色脂肪細(xì)胞，提高其釋放熱量的能力幫助機(jī)體在寒冷環(huán)境下維持體溫。

表觀遺傳是細(xì)胞在不改變基因核酸序列的情況下基因表達(dá)發(fā)生可遺傳改變。通過(guò)表觀遺傳試劑處理細(xì)胞可以改變細(xì)胞基因組的表觀遺傳特征，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平上改變其基因表達(dá)。Sang 等的研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳修飾的變化會(huì)影響脂肪細(xì)胞的基因表達(dá)和分化途徑。而在Meng 等的研究中則發(fā)現(xiàn)甲基化試劑5-氮-2'-脫氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR）處理會(huì)影響雞的肌內(nèi)脂肪沉積。而曲古霉素（Trichostatin A，TSA）則會(huì)影響3T3-L1 前脂肪細(xì)胞中的脂肪生成。但表觀遺傳是否會(huì)影響到民豬脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和產(chǎn)熱能力仍未有研究。

為揭示表觀遺傳對(duì)民豬脂肪細(xì)胞分化的影響，本研究采用5-Aza-CdR 和TSA 處理民豬前脂肪細(xì)胞，以研究其對(duì)前脂肪分化、產(chǎn)熱和棕色化相關(guān)基因表達(dá)和脂滴形成的影響。通過(guò)本研究來(lái)推測(cè)表觀遺傳在民豬抗寒能力形成中的作用，對(duì)于研究民豬抗寒機(jī)制、促進(jìn)民豬遺傳資源保護(hù)和利用具有理論意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 民豬脂肪組織采自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所養(yǎng)殖基地。

1.2 主要試劑 DMEM-F12、D-PBS（HyClone，美國(guó)）；胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）、胎牛血清（CORNING，美國(guó)）；I 型膠原酶、油紅O 染液、地塞米松（DEX）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、胰島素、羅格列酮、吲哚美辛、三碘甲狀腺原氨酸（T3）、焦碳酸二乙酯（DEPC）、胰蛋白胨、酵母提取物、二甲基亞砜（DMSO）、MTT、曲古抑菌素A（TSA）、5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）、抗體（Sigma，美國(guó)）；GAPDH 抗體（Bioworld Technology，美國(guó)）；Annexin V-Alexa Fluor 488/PI Kit 凋亡檢測(cè)試劑盒（四正柏，北京）。

引物合成由通用生物系統(tǒng)有限公司完成，測(cè)序由吉林庫(kù)美生物科技有限公司完成。

1.3 前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo) 民豬脂肪細(xì)胞的原代培養(yǎng)和前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)。主要方法如下：采集1 月齡民豬仔豬背部脂肪組織剪成1 cm ×1 cm 組織塊，消化后培養(yǎng)于含10% FBS 和1%雙抗的DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)液的生長(zhǎng)培養(yǎng)液中，每2 d更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)至細(xì)胞約80% 匯合時(shí)將培養(yǎng)液更換為DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)液添加10% FBS、0.5 mmoL/L IBMX、5 μg/mL 胰島素、1 μmoL/L 地塞米松、1 μmoL/L羅格列酮、1 μmoL/L 三碘甲狀腺原氨酸（T3）、1 μmoL/L吲哚美辛的誘導(dǎo)培養(yǎng)液。2 d 后換液，替換成只含有5 μg/mL 胰島素、1 μmoL/L 三碘甲狀腺原氨酸（T3）、1 μmoL/L 羅格列酮及10% FBS 的DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)液。此后每2 d 換培養(yǎng)液一次至8 d。

1.4 MTT 法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脂肪細(xì)胞活率 MTT 法檢測(cè)前在前脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)液中分別加入100、200、300、500、800 nmol/L 的5-Aza-CdR 處理48 h，用于檢驗(yàn)不同濃度5-Aza-CdR 對(duì)前脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。為檢驗(yàn)不同濃度TSA 作用，分別在前脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)液中加入100、150、200、500、800 nmol/L的TSA 處理24 h。2 組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后根據(jù)MTT 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞活率。

進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)的細(xì)胞在培養(yǎng)結(jié)束后按PI 染色試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，并上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞比例。

1.5 油紅O 染色 將脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化第8 天形成的成熟脂肪細(xì)胞用PBS 清洗3 次，4%多聚甲醛固定30 min后PBS 清洗3 次去除多聚甲醛，最后在培養(yǎng)皿中加入油紅O 工作液染色30 min，棄去油紅O 用PBS 清洗3 次，相差顯微鏡觀察脂滴染色情況。

1.6 RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)Trizol 試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取脂肪細(xì)胞總RNA。瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)提取的總RNA 質(zhì)量，選擇符合質(zhì)量要求的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

cDNA 反應(yīng)體系為（10 μL）：RT Primer Mix 1 μL，5×PrimeScript Buffer 2 4 μL，PrimeScript RT Enzyme MixI 1 μL，RNase Free Water 4 μL；條件為：37℃15 min，85℃5 s，4℃1 min。

1.7 基因定量引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI 上已公布的豬、、、、、、、序列，以豬-actin 作為內(nèi)參，Primer 5.0 設(shè)計(jì)定量引物。引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因定量引物序列

1.8 Real-time PCR 檢測(cè)基因表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)、、、、、、、mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，-actin為內(nèi)參，20 μL 反應(yīng)體系，含50 ng/μL cDNA 樣品1 μL，2×SYBR Green PCR Mixture 10 μL，上游引物0.5 μL（10 pmol），下游引物0.5 μL（10 pmol），滅菌水8 μL?；靹蚝?，進(jìn)行Real-time PCR，每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)重復(fù)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3 次。

反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃10 min；循環(huán)反應(yīng)95℃15 s，58℃1 min，40～45 個(gè)循環(huán)；融解曲線95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法 MTT 法統(tǒng)計(jì)細(xì)胞活率：酶標(biāo)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定490 nm 波長(zhǎng)下各孔內(nèi)吸光度A 值。細(xì)胞存活率計(jì)算公式：細(xì)胞生存率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A 值-空白對(duì)照組A 值）/（細(xì)胞陰性對(duì)照組A 值-空白對(duì)照組A 值）×100%。統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞存活率，SPSS 13.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

qRT-PCR 結(jié)果統(tǒng)計(jì)：以-actin 基因?yàn)閮?nèi)參，qRTPCR 數(shù)據(jù)采用2法分析，實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prisms 軟件中的One-way ANOVA 進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，<0.05 表示差異顯著，<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 5-Aza-CdR 和TSA 處理濃度的篩選 分別用100、200、300、500、800 nmol/L 的5-Aza-CdR 處理前脂肪細(xì) 胞48 h，100、150、200、500、800 nmol/L 的TSA處理前脂肪細(xì)胞24 h。處理完成后采用MTT 法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活率。MTT 法檢測(cè)2 種試劑處理后脂肪細(xì)胞活率，結(jié)果如圖1A 所示，隨著5-Aza-CdR 和TSA 處理濃度升高前脂肪細(xì)胞的活率會(huì)相應(yīng)降低，其中當(dāng) 5-Aza-CdR 處理濃度在0～500 nmol/L 之間時(shí)細(xì)胞活率降低緩慢，但當(dāng)其濃度超過(guò)500 nmol/L 后細(xì)胞活率迅速顯著降低；與5-Aza-CdR 相似，當(dāng)TSA 的處理濃度低于150 nmol/L 時(shí)，細(xì)胞活率降低慢，但當(dāng)處理濃度高于150 nmol/L 后細(xì)胞活率迅速降低。因此，實(shí)驗(yàn)選擇采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)500 nmol/L 的5-Aza-CdR處理48 h 和150 nmol/L 的TSA 處理24 h 后的凋亡情況，如圖1B 所示，細(xì)胞活率與正常對(duì)照組差異不顯著。但當(dāng)5-Aza-CdR 和TSA 濃度繼續(xù)上升，脂肪細(xì)胞的活率迅速下降。因此，在本研究條件下，選擇500 nmol/L的5-Aza-CdR 和150 nmol/L 的TSA 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物處理濃度。

圖1 5-Aza-CdR 和TSA 處理濃度的篩選

2.2 5-Aza-CdR 對(duì)脂肪分化相關(guān)基因和脂滴形成的影響在前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化誘導(dǎo)開(kāi)始的同時(shí)加入500 nmol/L 5-Aza-CdR 和誘導(dǎo)分化藥物，8 d 后收集成熟脂肪細(xì)胞qPCR 檢測(cè)相關(guān)基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖2A 所示。被檢測(cè)的、、、、和相對(duì)表達(dá)量均顯著下降，分別為對(duì)照組的0.61、0.37、0.42、0.34、0.40、0.36 倍。同時(shí)ZNF423 蛋白表達(dá)檢測(cè)表明ZNF423 蛋白表達(dá)量略有降低（圖2B）。油紅O 檢測(cè)成熟脂肪細(xì)胞中的脂滴數(shù)量，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的脂滴數(shù)量低于對(duì)照組（圖2C）。結(jié)果表明：5-Aza-CdR 處理前脂肪細(xì)胞后能夠降低甲基化和棕色脂肪分化相關(guān)基因的表達(dá)量，并抑制脂滴生成。

圖2 5-Aza-CdR 對(duì)脂肪分化相關(guān)基因和脂滴形成的影響

2.3 TSA 對(duì)脂肪細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá)的影響 在前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化0 d 時(shí)加入TSA 和誘導(dǎo)藥物，形成成熟脂肪細(xì)胞后qPCR 檢測(cè)相關(guān)基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果如圖3A 所示，和的mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著下降，分別為對(duì)照組的0.65 倍和0.73 倍，而、、和的mRNA 相 對(duì)表達(dá)量均顯著升高，分別為對(duì)照組的1.61、1.45、1.46、1.29 倍。Western blot 檢測(cè)ZNF423 蛋白表達(dá)量顯示其蛋白表達(dá)量顯著升高（圖3B）。油紅O 檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的脂滴生成情況（圖3C）發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組脂滴數(shù)量為對(duì)照組脂滴數(shù)量的1.23 倍。結(jié)果表明：TSA 處理前脂肪細(xì)胞后能夠抑制組蛋白去乙?；副磉_(dá)，提高其他相關(guān)基因的表達(dá)量，并促進(jìn)脂滴生成。

圖3 TSA 對(duì)脂肪分化相關(guān)基因和脂滴形成的影響

3 討 論

表觀遺傳是在不改變DNA 序列的情況下，通過(guò)可逆的核苷酸或核小體修飾來(lái)影響基因表達(dá)，主要途徑包括DNA 修飾、RNA 修飾、組蛋白修飾等。5-Aza-CdR與TSA 是比較常用的2 種表觀遺傳試劑，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞基因發(fā)生表觀遺傳修飾。它們?cè)谒幮Х矫娑季哂械蜐舛日T導(dǎo)細(xì)胞的凋亡、高濃度可引起細(xì)胞壞死的特征。但它們對(duì)細(xì)胞的作用具有時(shí)間和濃度依賴性，最適時(shí)間和濃度因細(xì)胞種類不同而差異極大。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度的5-Aza-CdR 和TSA 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響較小，但達(dá)到臨界點(diǎn)后繼續(xù)提高濃度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力的急劇下降。

5-Aza-CdR 作為一種DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，能夠整合進(jìn)入DNA、降低DNA 甲基化程度。和是催化基因組從頭和維持甲基化的主要DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）成員，在前脂肪細(xì)胞中加入5-Aza-CdR 后，它們表達(dá)量的降低會(huì)顯著降低細(xì)胞全基因組甲基化的水平，調(diào)控特定基因的表達(dá)。TSA是一種組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑，能夠上調(diào)組蛋白H3 乙?；剑淖?nèi)旧w結(jié)構(gòu)和促進(jìn)沉默的基因表達(dá)。Chi 等的研究表明，不會(huì)影響核基因的表達(dá)，但會(huì)轉(zhuǎn)位至線粒體，使其中的乙酰基酶（FAO）線粒體三功能酶亞基脫乙?；⑹蛊涫Щ?，降低細(xì)胞產(chǎn)熱能力。Chun 等敲除小鼠的前脂肪細(xì)胞中的后發(fā)現(xiàn)脂肪分化速度加快，而在3T3-L1中過(guò)表達(dá)則抑制脂肪分化。Fuks 等針對(duì)這2 種表觀修飾途徑的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，DNA 甲基化與組蛋白去乙酰化確實(shí)存在正相關(guān)性，更是能與HDAC 直接結(jié)合，協(xié)同發(fā)揮作用。

白色脂肪細(xì)胞主要是能量貯存，而棕色脂肪細(xì)胞和米色脂肪細(xì)胞能夠代謝產(chǎn)生大量熱量用于維持機(jī)體溫度。、、和均與脂肪細(xì)胞棕色化和能量調(diào)節(jié)相關(guān)。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR-）能夠調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶體增殖劑基因轉(zhuǎn)錄活性、促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化、參與體內(nèi)能量代謝，PPAR-基因的上調(diào)可導(dǎo)致脂肪酸分解產(chǎn)熱增加。核受體轉(zhuǎn)錄共抑制因子1（）作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子廣泛參與脂肪代謝相關(guān)的能量利用過(guò)程。權(quán)德賢等的研究發(fā)現(xiàn)，缺失的小鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的對(duì)寒冷刺激的耐受,小鼠適應(yīng)性產(chǎn)熱能力顯著改善,其皮下脂肪組織更容易發(fā)生寒冷環(huán)境誘導(dǎo)的組織褐化。鋅指蛋白423（）是脂肪細(xì)胞在早期分化過(guò)程中的重要調(diào)控因子，抑制白色脂肪向米色脂肪轉(zhuǎn)化。ZFP423 和棕色脂肪決定因子之間存在著蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用對(duì)于抑制白色脂肪組織（WAT）的產(chǎn)熱表型至關(guān)重要。在本研究中，前脂肪細(xì)胞經(jīng)5-Aza-CdR 處理后，分化成熟的脂肪細(xì)胞中與能量代謝和棕色化相關(guān)的基因表達(dá)量均出現(xiàn)下降。相反，用TSA 處理后這些基因的表達(dá)則略有上升。對(duì)2 組成熟脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅O檢測(cè)脂滴生成情況發(fā)現(xiàn)，5-Aza-CdR 組較對(duì)照組脂滴減少，TSA 組較對(duì)照組脂滴增多。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，脂肪細(xì)胞的分化受到表觀遺傳試劑5-Aza-CdR 和TSA 的影響，5-Aza-CdR 處理會(huì)促進(jìn)前脂肪細(xì)胞向棕色或米色脂肪方向分化，同時(shí)抑制白色脂肪形成和沉積，而TSA 的作用則正好相反。因此可以推測(cè)，外界環(huán)境可能通過(guò)表觀遺傳方式調(diào)節(jié)民豬前脂肪細(xì)胞的分化增加或降低成熟脂肪細(xì)胞的產(chǎn)熱能力，并最終影響民豬對(duì)環(huán)境溫度的適應(yīng)性。