江培濤，吳 鈞，方 敏，馬 超，李琛澤

1.南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院/揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇揚(yáng)州 211900；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京 210029

肺炎克雷伯菌(KP)是臨床常見(jiàn)的革蘭陰性條件致病菌，可以引起呼吸道、尿道、血流等多種感染性疾病。除頭孢菌素等β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物之外，左氧氟沙星(LVX)等氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物因?yàn)榫哂锌诜蘸谩⑸锢枚雀?、不良反?yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，也常常作為成年人KP感染的治療選擇。但是，近年來(lái)KP引起的醫(yī)院感染及其耐藥率逐年增高，尤其是以耐碳青霉烯類(lèi)藥物為代表的多重耐藥KP感染的不斷增加，常常導(dǎo)致抗菌治療失敗、住院時(shí)間延長(zhǎng)、治療費(fèi)用增加，甚至病死率增高等不良后果，因而如何治療多重耐藥KP感染逐漸成為臨床醫(yī)師面臨的難題。外排泵系統(tǒng)的高度表達(dá)是KP獲得多重耐藥的機(jī)制之一，其中屬于耐藥結(jié)節(jié)分化(RND)家族的AcrAB-TolC外排泵在腸桿菌科中檢出率最高[1]。由外排泵介導(dǎo)的KP對(duì)碳青霉烯類(lèi)、替加環(huán)素等抗菌藥物的耐藥機(jī)制研究已屢見(jiàn)不鮮，而外排泵介導(dǎo)KP對(duì)喹諾酮類(lèi)耐藥機(jī)制報(bào)道相對(duì)較少。本研究擬探討外排泵OqxAB、AcrAB和QepA在KP臨床菌株中的基因表達(dá)情況及其在KP對(duì)LVX耐藥中的作用，以期為臨床預(yù)防和控制多重耐藥KP感染提供更多理論參考。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 106株KP分離自江蘇省儀征市南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院2018年7月至2020年12月的門(mén)診和住院患者，已剔除同一患者相同部位的重復(fù)分離株。標(biāo)本來(lái)源：重癥監(jiān)護(hù)病房24株，呼吸內(nèi)科31株，神經(jīng)外科20株，胸外科13株，兒科6株，其他科室12株；標(biāo)本類(lèi)型：痰及肺泡灌洗液74株，尿液18株，膿液及傷口分泌物7株，血液4株，導(dǎo)管3株。質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌ATCC 25922、KP ATCC 700603，均購(gòu)自生物梅里埃公司。

1.2主要儀器與試劑 GHP-9270數(shù)顯隔水式恒溫孵育箱(上海精宏醫(yī)療器械廠)；MicroScan WalkAway 96 Plus 細(xì)菌鑒定藥敏分析儀(美國(guó)貝克曼公司)；TGL-18R冷凍高速離心機(jī)(珠海Hema醫(yī)學(xué)儀器公司)；NanoDrop2000分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)；ABI7500PCR儀(美國(guó)ABI公司)；LVX注射液(浙江醫(yī)藥股份有限公司)；LB肉湯(杭州百思生物技術(shù)公司)；水解酪蛋白(MH)瓊脂(杭州濱河生物技術(shù)公司)；細(xì)菌基因組實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)試劑盒(北京天根生化科技公司)；瓊脂糖(廣州賽國(guó)生物科技公司)。

1.3菌株鑒定和藥物敏感試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)藥敏試驗(yàn)) 所有菌株的分離培養(yǎng)均嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版操作，菌種鑒定和LVX等常規(guī)藥敏試驗(yàn)(微量肉湯稀釋法)均由MicroScan WalkAway 96 Plus系統(tǒng)完成。所有菌株的鑒定均通過(guò)PCR檢測(cè)rpoB基因進(jìn)行確認(rèn)。藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)參照2018版臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)M100[2]執(zhí)行，以LVX的最低抑菌濃度(MIC)≤2.00 μg/mL為敏感，MIC=4.00 μg/mL為中介，MIC≥8.00 μg/mL為耐藥。隨機(jī)選取24株對(duì)LVX耐藥的KP作為試驗(yàn)組，另隨機(jī)選取27株對(duì)LVX非耐藥的KP(25株敏感，2株中介)作為對(duì)照組進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4KP的外排泵表型測(cè)定 參照文獻(xiàn)[3-4]以KP ATCC700603標(biāo)準(zhǔn)株生長(zhǎng)良好的羰基氰氯苯腙(CCCP)溶液水平25 μg/mL為外排泵抑制劑工作水平；采用微量肉湯稀釋法分別測(cè)定加入CCCP前后LVX對(duì)兩組KP的MIC，同時(shí)以不含藥物的肉湯作為生長(zhǎng)對(duì)照。本試驗(yàn)以加入外排泵抑制劑后LVX的MIC值降低至原值的1/4或更低作為外排泵表型陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.5外排泵基因檢測(cè) 采用qRT-PCR檢測(cè)外排泵OqxAB、AcrAB和QepA相應(yīng)表達(dá)基因OqxA、acrB和QepA的表達(dá)水平。用陽(yáng)離子調(diào)節(jié)的MH肉湯稀釋的隔夜細(xì)菌培養(yǎng)物在35 ℃下生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)階段，搖動(dòng)混勻(200 r/min)。在無(wú)RNase的環(huán)境中，用Trizol法從分離物中提取總RNA。測(cè)定RNA的產(chǎn)量和質(zhì)量，然后將RNA水平調(diào)整到150 ng/mL。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所有分離物的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；然后用qRT-PCR(60 ℃ 30 s；50 ℃ 5 min；95 ℃ 10 min；40次循環(huán)95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min；60 ℃ 30 s)對(duì)靶基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。以KP ATCC700603作為參考菌株(表達(dá)水平=1)，用2-ΔΔCt方法根據(jù)管家基因rrsE(KP)的表達(dá)計(jì)算被測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量，所有標(biāo)本3復(fù)孔測(cè)定，取平均值。用于上述基因檢測(cè)的引物(表1)合成及上述試驗(yàn)由南京祖和生物技術(shù)公司完成。

1.6acrR基因突變檢測(cè) 對(duì)LVX耐藥KP臨床分離株，用表1所述引物進(jìn)行PCR并測(cè)序，以證實(shí)acrR中相對(duì)于參考KP株MGH78578(CP000647)[5]的突變存在。

表1 相關(guān)基因引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用Whonet5.6軟件進(jìn)行抗菌藥物敏感性統(tǒng)計(jì)；用SPSS20.0軟件通過(guò)t檢驗(yàn)分析兩組之間基因表達(dá)水平的差異；用線性回歸分析MIC與基因表達(dá)水平之間的關(guān)系；采用χ2或Fisher確切概率法分析兩組之間外排泵表型的差異。以P<0.05(雙側(cè))為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1藥敏試驗(yàn)及菌株確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果 106株KP對(duì)LVX的敏感率為69.8%(74/106)，中介率為3.8%(4/106)，耐藥率為26.4%(28/106)，見(jiàn)表2。rpoB基因PCR電泳結(jié)果顯示，隨機(jī)選取的51株菌株均為KP，見(jiàn)圖1。

表2 106株KP對(duì)常用抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果[%(n)]

注：試驗(yàn)組01～24分別對(duì)應(yīng)菌株號(hào)為L(zhǎng)VX-R2、LVX-R7、LVX-R11、LVX-R15、LVX-R26、LVX-R32、LVX-R39、LVX-R42、LVX-R53、LVX-R67、LVX-R69、LVX-R71、LVX-R72、LVX-R74、LVX-R77、LVX-R79、LVX-R89、LVX-R94、LVX-R96、LVX-R97、LVX-R100、LVX-R106、LVX-R108、LVX-R111的KP；對(duì)照組01～27分別對(duì)應(yīng)菌株號(hào)為L(zhǎng)VX-S66、LVX-S68、LVX-S70、LVX-S75、LVX-S76、LVX-S78、LVX-S80、LVX-S81、LVX-S82、LVX-S83、LVX-S84、LVX-S85、LVX-S86、LVX-S87、LVX-S88、LVX-S90、LVX-S91、LVX-S92、LVX-S93、LVX-S95、LVX-S98、LVX-S99、LVX-S101、LVX-S102、LVX-S113、LVX-S62、LVX-S103的KP。M為DNA Marker，條帶大小從上至下依次為1 000、700、500、400、300、200、100 bp。

2.2外排泵表型試驗(yàn)結(jié)果 隨機(jī)選擇的51株KP中，9株外排泵表型試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性(17.6%)。參照CLSI M100(S28)標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)組中有3株KP表現(xiàn)為外排泵表型試驗(yàn)陽(yáng)性，其中2株對(duì)LVX耐藥逆轉(zhuǎn)為敏感；對(duì)照組中有6株KP表現(xiàn)為外排泵表型試驗(yàn)陽(yáng)性，其中2株對(duì)LVX中介的菌株均表現(xiàn)為外排泵表型試驗(yàn)陽(yáng)性，且均逆轉(zhuǎn)為敏感，25株對(duì)LVX敏感的菌株中有4株表現(xiàn)為外排泵表型試驗(yàn)陽(yáng)性。試驗(yàn)組、對(duì)照組外排泵表型試驗(yàn)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.293,P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組KP臨床分離株外排泵表型試驗(yàn)結(jié)果

2.3qRT-PCR結(jié)果 兩組KP外排泵基因OqxA、QepA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.651、-0.669，P=0.518、0.506，圖2A、2B)，而acrB表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.76，P<0.001，圖2C)，且試驗(yàn)組acrB表達(dá)水平與LVX的log2MIC呈正相關(guān)(r=0.544，P=0.006，圖2D)。

注：A、B、C分別為兩組KP外排泵基因OqxA、QepA、acrB表達(dá)水平比較；D為外排泵基因acrB表達(dá)水平與log2 MIC間關(guān)系散點(diǎn)圖。。

2.4acrR基因突變檢測(cè) 試驗(yàn)組acrR基因PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序結(jié)果顯示菌株02(LVX-R7)、03(LVX-R11)、05(LVX-R26)、07(LVX-R39)、11(LVX-R69)、12(LVX-R71)、18(LVX-R94)、21(LVX-R100)、23(LVX-R108)、24(LVX-R111)擴(kuò)增出969 bp大小(野生型)的目的片段，而其余14株(58.3%)均擴(kuò)增出2 000 bp大小(突變型)的條帶(圖3)。經(jīng)測(cè)序比對(duì)，兩種產(chǎn)物與美國(guó)生物信息中心基因庫(kù)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中KP株MGH78578序列一致性達(dá)到98%以上。突變型菌株序列改變主要為堿基置換(圖4、5)。10株攜帶野生型acrR基因的菌株與14株攜帶突變型acrR基因的菌株acrB基因表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t′=0.993，P=0.347)。

注：01～24分別對(duì)應(yīng)試驗(yàn)組菌株號(hào)為L(zhǎng)VX-R2、LVX-R7、LVX-R11、LVX-R15、LVX-R26、LVX-R32、LVX-R39、LVX-R42、LVX-R53、LVX-R67、LVX-R69、LVX-R71、LVX-R72、LVX-R74、LVX-R77、LVX-R79、LVX-R89、LVX-R94、LVX-R96、LVX-R97、LVX-R100、LVX-R106、LVX-R108、LVX-R111的KP；M為DNA Marker。

圖4 試驗(yàn)組部分突變型菌株acrR基因正向測(cè)序峰圖

圖5 試驗(yàn)組部分突變型菌株acrR基因堿基序列比對(duì)圖

3 討 論

KP是臨床常見(jiàn)的條件致病菌，2019年CHINET三級(jí)醫(yī)院數(shù)據(jù)表明，其在臨床標(biāo)本中的檢出率為15.17%，僅次于大腸埃希氏菌，且該菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)的耐藥率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別從2005年的3.0%、2.9%上升至2019年的25.3%、26.8%，對(duì)環(huán)丙沙星耐藥率從2005年的41.0%逐年下降至2014年的22.4%后又回升至2019年的38.1%，對(duì)LVX的耐藥率從2017年的26.6%上升至2019年的33.4%[10]。本研究中106株KP對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為23.6%和25.5%，對(duì)環(huán)丙沙星和LVX的耐藥率為分別為27.4%和26.4%，均低于全國(guó)水平。分析差異產(chǎn)生的原因，可能與南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院收治病種及抗菌藥物可選種類(lèi)與三級(jí)醫(yī)院不同有關(guān)，后者收治患者病情相對(duì)復(fù)雜，醫(yī)院獲得性感染及多重耐藥菌感染常見(jiàn)，抗菌藥物選擇壓力大，導(dǎo)致多種抗菌藥物的耐藥率較高。

LVX屬于第3代喹諾酮類(lèi)抗菌藥物，一般用于治療成人呼吸道、泌尿生殖道和皮膚軟組織等感染，該藥具有廣譜抗菌作用，對(duì)多數(shù)腸桿菌目細(xì)菌、革蘭陽(yáng)性菌、肺炎支原體和衣原體有抗菌作用。本研究表明LVX體外抗菌活性強(qiáng)于第2代喹諾酮類(lèi)抗菌藥物環(huán)丙沙星，這與全國(guó)數(shù)據(jù)一致[10]。LVX主要作用機(jī)制是通過(guò)抑制細(xì)菌DNA解旋酶的活性，阻止細(xì)菌DNA的合成而導(dǎo)致菌體死亡。

研究表明，KP對(duì)氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的耐藥機(jī)制除了DNA解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶突變之外，質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥、外膜通透性下降以及外排泵因素都有作用[1,11-12]。AcrAB-TolC外排泵系統(tǒng)廣泛分布于革蘭陰性菌中，屬于RND超家族，以質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力為能量，通過(guò)外排泵將進(jìn)入菌體內(nèi)的藥物或?qū)ψ陨碛泻Φ奈镔|(zhì)排出體外[1]。同時(shí)文獻(xiàn)[4,13]報(bào)道，KP AcrAB-TolC外排泵可能與其毒力有關(guān)，該外排泵主要由膜融合蛋白(AcrA)、外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AcrB)和外膜通道蛋白(TolC)3部分組成。有關(guān)外排泵介導(dǎo)KP耐藥多見(jiàn)于KP對(duì)碳青霉烯類(lèi)、替加環(huán)素等限制使用級(jí)抗菌藥物耐藥的報(bào)道中[8,13-14]，但有關(guān)外排泵介導(dǎo)KP對(duì)LVX耐藥性與外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因表達(dá)水平和調(diào)節(jié)因子變異之間關(guān)系的研究尚不多見(jiàn)。本研究顯示，對(duì)LVX耐藥的24株KP(試驗(yàn)組)中，有3株表現(xiàn)為外排泵表型試驗(yàn)陽(yáng)性，其中2株對(duì)LVX耐藥逆轉(zhuǎn)為敏感；對(duì)LVX非耐藥的27株KP(對(duì)照組)中，6株表現(xiàn)為外排泵表型試驗(yàn)陽(yáng)性，其中2株對(duì)LVX耐藥逆轉(zhuǎn)為敏感，但兩組的外排泵表型試驗(yàn)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這說(shuō)明外排泵可能廣泛流行于KP中，但本研究樣本量小，其真實(shí)差異有待進(jìn)一步研究。值得一提的是，本研究是一項(xiàng)回顧性分析，2019年CLSI將腸桿菌目LVX的敏感性折點(diǎn)修訂至MIC≤0.5 μg/mL，若以此為標(biāo)準(zhǔn)則外排泵表型陽(yáng)性菌株均集中在對(duì)LVX耐藥和中介的菌株中，且中介菌株全部表現(xiàn)為外排泵表型陽(yáng)性并可逆轉(zhuǎn)為對(duì)LVX敏感。該結(jié)果說(shuō)明外排泵在KP對(duì)LVX的耐藥機(jī)制中起到一定作用。本研究進(jìn)一步分析了KP 3種外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因OqxA、QepA和acrB表達(dá)水平與LVX MIC的關(guān)系，結(jié)果顯示OqxA、QepA表達(dá)水平與MIC的升高并無(wú)相關(guān)性，這與文獻(xiàn)[8]報(bào)道相近。但試驗(yàn)組與對(duì)照組的acrB表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.76，P<0.001)，且acrB表達(dá)水平與LVX的log2MIC呈正相關(guān)(r=0.544，P=0.006)，說(shuō)明AcrAB外排系統(tǒng)可能是介導(dǎo)KP耐藥的一個(gè)重要機(jī)制。需要指出的是，本研究中OqxA在對(duì)LVX敏感的KP中的表達(dá)水平高于對(duì)LVX耐藥的KP，這與翟俊斌[15]等關(guān)于對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥的KP的研究一致。類(lèi)似的研究結(jié)果表明OqxAB外排系統(tǒng)雖廣泛分布于KP中，但并不是介導(dǎo)KP對(duì)LVX、碳青霉烯類(lèi)等抗菌藥物耐藥的機(jī)制，這與以往的報(bào)道不同[16-17]，其機(jī)制和原因有待深入研究。

研究表明，AcrAB-TolC外排泵的調(diào)控體系中，整體調(diào)控因子MarA和RamA增加該泵的外排作用，局部調(diào)控因子acrR阻遏AcrAB的外排作用[18]。據(jù)此推斷acrR的低表達(dá)或突變導(dǎo)致的外排阻遏功能缺失將會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增高，本研究分析了對(duì)LVX耐藥的KP的局部調(diào)控因子acrR的突變現(xiàn)象，在24株耐藥的KP中，有14株(58.3%)發(fā)生了acrR基因突變，突變的主要類(lèi)型為堿基置換。但攜帶突變型acrR基因的KP(14株)的acrB基因表達(dá)水平并不顯著高于攜帶野生型acrR基因的KP(10株)。因而推測(cè)acrR因子的阻遏調(diào)節(jié)在AcrAB-TolC外排泵介導(dǎo)的KP對(duì)LVX耐藥中不占主導(dǎo)作用，在10株含野生型acrR基因的對(duì)LVX耐藥的KP中，其他機(jī)制可能共同介導(dǎo)了該菌對(duì)LVX的耐藥。本研究尚存在一定局限性，如樣本量較小，還需積累樣本量，對(duì)OqxA在對(duì)LVX敏感KP中的表達(dá)水平高于對(duì)LVX耐藥KP的機(jī)制進(jìn)一步研究。

綜上所述，外排泵OqxAB、AcrAB和QepA雖然廣泛流行于革蘭陰性菌中，尤其是OqxAB在KP中廣泛表達(dá)，但介導(dǎo)KP對(duì)LVX耐藥的主要外排系統(tǒng)是AcrAB。