尹緒鳳，陳少軍，李文斌

1.湖北醫(yī)藥學院附屬國藥東風總醫(yī)院兒科，湖北十堰 442000；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院兒科，湖北武漢 430030

新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是指在圍生期因各種因素導致窒息，進而引起胎兒或新生兒缺氧缺血性腦損傷[1]。多數學者認為新生兒HIE發(fā)病機制復雜，通常是多種機制相互作用導致的病理結果，主要包含因腦血流量降低、腦組織供氧不足繼而引發(fā)氧化應激反應、大腦興奮性氨基酸釋放、炎癥相關因子釋放、血腦屏障破壞等[2-3]。相關數據顯示，我國HIE的發(fā)病率為3‰～6‰，15%～20%的HIE患兒在新生兒期發(fā)生死亡，25%～30%的HIE患兒則出現嚴重、永久、不可逆性的神經功能障礙[4]。

HIE患兒的臨床癥狀是其主要診斷依據，對其進行臨床評估通常采用的是北京協(xié)和醫(yī)院鮑秀蘭教授提出的20項新生兒行為神經測定(NBNA)評分。該評分法結合了美國Brazelton新生兒行為測定和法國Ameil-Tison神經運動測定方法的優(yōu)點，具有可操作性強、可信度高、靈敏度及特異度高的優(yōu)點[5-6]。

目前HIE輔助檢查主要包括顱腦彩超、頭顱CT、核磁共振、腦電圖等，但是越來越多臨床研究發(fā)現，神經損傷標志物水平可預測神經系統(tǒng)是否存在病理損傷[7-9]，現已成為醫(yī)學研究熱點。神經損傷標志物大多是與神經組織密切相關的生物蛋白，當神經系統(tǒng)受到一定程度損傷時，此類生物蛋白將會發(fā)生特異性改變，常見神經損傷標志物有S100鈣結合蛋白B(S100B)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、泛素羧基末端水解酶L1(UCHL-1)和髓鞘堿性蛋白(MBP)、膠原纖維酸性蛋白(GFAP)等。GFAP是星形膠質細胞特異性細胞骨架蛋白，正常情況下，GFAP在細胞內或細胞外自發(fā)降解，通過腦脊液循環(huán)于腦室系統(tǒng)與脊髓中，血中GFAP水平較穩(wěn)定；當腦部發(fā)生損傷后，星形膠質細胞大量增生導致GFAP表達增加，GFAP通過血腦屏障進入血液中，使得血中GFAP水平上調[10]。故本研究對不同病情嚴重程度、不同日齡足月HIE患兒的血清GFAP水平、NBNA評分情況及二者之間的相關性進行分析，以期對HIE患兒的早期診斷、病情嚴重程度、預后判斷以及指導臨床治療提供一定理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2019年12月湖北醫(yī)藥學院附屬國藥東風總醫(yī)院收治的90例診斷為HIE的新生兒作為HIE組，依據病情嚴重程度將患兒分為輕度組(40例)、中度組(28例)、重度組(22例)，并隨機選取同時期產科70例健康足月新生兒作為本臨床試驗對照組。本研究經湖北醫(yī)藥學院附屬國藥東風總醫(yī)院倫理委員會批準，各研究對象家屬均已簽署臨床試驗知情同意書。

1.2納入標準 HIE組納入標準：(1)所有患兒均為足月兒(胎齡37～42周)；(2)出生體質量2.5～4.0 kg；(3)患兒均符合2005年中華醫(yī)學會兒科學分會新生兒組制訂的HIE臨床診斷及分度標準[11]。對照組納入標準：(1)胎齡37～42周；(2)出生體質量2.5～4.0 kg；(3)有正常的Apgar評分；(4)孕母在妊娠期身體健康；(5)新生兒無先天畸形、窒息史及神經系統(tǒng)病癥等表現。

1.3方法

1.3.1標本采集及GFAP檢測 所有納入本研究的新生兒在日齡1、3、7 d時分別采集外周靜脈血2～3 mL。將采集的血液標本靜置5～10 min后離心，設置離心機轉速為3 000 r/min，離心時間為10 min，離心后取上清液，置于-80 ℃冰箱保存待測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清GFAP水平，人GFAP ELISA試劑盒(ab223867)由上海艾博抗公司提供。用已知濃度的GFAP抗體包被微孔酶標板，制成相對抗體，向包被單抗的微孔酶標板中依次加入待檢測血清標本、標準品，待檢測標本中的人GFAP與生物素和親和素相結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經徹底洗滌后加顯色底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色。TMB在辣根過氧化物酶的催化下轉化成藍色，在終止液的作用下最終轉化為黃色。顏色的深淺與待測標本中GFAP水平呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度值，通過標準曲線計算樣本中GFAP水平。

1.3.2NBNA評分 分別在新生兒日齡3、7 d時進行NBNA評分。NBNA評分內容包括新生兒行為能力、主動肌張力、被動肌張力、原始反射、一般評估5個部分共20項，以上每項評分有3個分度(0、1、2分)，總分0～40分，評分>35分為合格，評分≤35分則記為不合格，提示有腦損傷。

1.3.3資料收集 收集所有受試新生兒胎齡、出生體質量、性別、分娩方式等一般資料。

2 結 果

2.1各組一般資料比較 HIE各亞組和對照組間胎齡、出生體質量、性別比例、分娩方式比例比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組一般資料比較

2.2各組血清GFAP水平比較 同一時間點各組間血清GAFP水平差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中：日齡1、3 d時HIE各亞組均明顯高于對照組，日齡7 d時中、重度組高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；同一時間點HIE各亞組間兩兩比較比較，日齡1 d時重度組高于輕、中度組，日齡3 d、7 d時中、重度組高于輕度組且重度組高于中度組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.016 7)。HIE各亞組不同時間點血清GAFP水平比較：輕度組日齡3 d時較日齡1 d時明顯上升，日齡7 d時較日齡1、3 d時均有所下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中、重度組日齡3、7 d時較日齡1 d時明顯上升，日齡7 d時較日齡3 d時有所下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組新生兒血清GFAP水平變化趨勢圖

表2 各組間及不同時間點血清GFAP水平比較

2.3各組NBNA評分比較 日齡3 d時HIE各亞組NBNA評分均明顯低于對照組，日齡7 d時中、重度組明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而輕度組與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；同一時間點HIE各亞組兩兩比較，日齡3、7 d時輕、中、重度組NBNA評分依次呈遞減趨勢，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.016 7)；日齡7 d時，HIE各亞組NBNA評分均較日齡3 d時升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組日齡3、7 d時NBNA評分比較分)

2.4日齡3、7 d時的HIE組血清GFAP水平與NBNA評分的相關性分析 Pearson相關分析顯示，日齡3、7 d時，HIE組血清GFAP水平與NBNA評分均呈負相關(r=-0.671、-0.825，P<0.01)。見圖2。

注：A、B分別為日齡3、7 d時HIE組血清GFAP水平與NBNA評分間關系散點圖。

3 討 論

HIE與感染性腦損傷、膽紅素腦病并稱為新生兒三大腦損傷疾病[12]。HIE發(fā)病機制復雜，是多種機制與途徑共同導致的急性或慢性腦損傷。HIE可發(fā)生在圍生期任何階段，分娩前、分娩時、分娩后的多種因素均可導致缺氧缺血性腦損傷[13-14]。而HIE新生兒的干預時機十分重要，臨床醫(yī)生需要早期發(fā)現其行為神經異常表現。因此，新生兒行為神經檢查是近20年來國際兒科領域重要進展及研究重點之一。通過對新生兒行為神經進行合理評估，可以全面、完善、精細地評估新生兒的精神狀態(tài)、行為能力和各種神經反射。目前我國通常采用北京協(xié)和醫(yī)院鮑秀蘭教授制訂的NBNA評分法。相對于其他行為神經評估法而言，NBNA評分簡單，培訓時間短，檢查時間僅需10 min，具有可操作性強，可反復測定，無痛苦，以及無傷害等特點，其結果可靠，靈敏度及特異度高。另一方面，NBNA評分是基于中國新生兒制訂，能更加全面地評價新生兒的行為能力，也是我國臨床上目前使用最為廣泛的一種新生兒行為神經評定方法。

隨著分子生物學快速發(fā)展，分子生物學病理診斷對早期發(fā)現病變有重要意義。疾病早期，血清標志物的出現往往早于組織學病變[15]，因此，在疾病早期加強對血清標志物檢測，有利于更早發(fā)現異常，進而彌補目前傳統(tǒng)輔助檢查的缺陷與不足。基于此，神經損傷標志物在臨床上對HIE患兒早期診斷具有指導意義?，F今為止，已有超過120種血清神經損傷標志生物蛋白被具體描述[16]，臨床研究較多的神經損傷標志物主要包括GFAP、NSE、S100B、UCHL-1、MBP等。其中，GFAP是星形膠質細胞中的一種細胞骨架蛋白，在神經再生和維持星形膠質細胞形態(tài)功能正常具有重要作用[17]。星形膠質細胞神經元與毛細血管壁共同組成了中樞神經系統(tǒng)的血腦屏障，因此，腦脊液或血清中GFAP水平在一定程度上可反映血腦屏障功能[18]。當中樞神經系統(tǒng)受損后，星形膠質細胞活化增生，主要表現為GFAP快速合成，并且在血清中或腦脊液中水平增加。因此，有學者認為，星形膠質細胞激活增多可以間接反映出神經損傷的嚴重程度，故血清或腦脊液GFAP水平可作為評估腦部受損與否及受損程度的新型指標[19]。

本研究通過對不同日齡各亞組HIE患兒血清GFAP水平進行檢測，發(fā)現不論其病情輕重，在日齡1 d時，血清GFAP水平較對照組均有所上升(P<0.01)，提示HIE患兒發(fā)病早期，血清GFAP水平即發(fā)生異常。對不同病情嚴重程度HIE患兒血清標本進行檢測分析發(fā)現，血清GFAP水平在日齡3、7 d時隨病情嚴重程度加重而升高，即輕度組低于中度組，中度組低于重度組，與既往的研究結果相一致[9]。另外在不同時間點對HIE各亞組血清GFAP水平進行比較，日齡3 d時血清GFAP水平最高，考慮其原因可能為此階段大腦處于損傷極期，腦組織及神經元發(fā)生壞死、腦水腫、腦出血、腦梗死等病理改變，致使血腦屏障通透性增加，星形膠質細胞內鈣超載，細胞功能穩(wěn)態(tài)受破壞，細胞內環(huán)境發(fā)生改變，星形膠質細胞的壞死及活化增生刺激GFAP大量合成釋放，導致血清GFAP水平升高。有臨床試驗表明，HIE患兒在出生后3～4 d血清GFAP水平的變化可預測其腦損傷程度及遠期的運動發(fā)育狀況[10]。

本研究對納入的研究對象進行NBNA評分，結果顯示HIE組不論病情輕重，在日齡3 d時NBNA評分均低于對照組(P<0.01)，且HIE各亞組間比較，日齡3、7 d時輕度組、中度組和重度組NBNA評分依次呈遞減趨勢(P<0.016 7)；當日齡7 d時，輕度組HIE患兒NBNA評分有所恢復，與對照組新生兒差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而中度組與重度組依然低于對照組(P<0.016 7)。本研究中HIE各亞組的NBNA評分在日齡3 d時NBNA評分低，提示對日齡3 d以內的HIE患兒應仔細觀察其行為神經狀態(tài)，并予以適當的良性刺激，改善患兒預后。

本研究分析了日齡3、7 d時HIE患兒GFAP水平與NBNA評分的相關性，結果提示血清GFAP水平越高，患兒NBNA評分越低，二者呈明顯負相關(r=-0.671、-0.825，P<0.01)。研究表明，HIE患兒中樞神經系統(tǒng)損傷的主要原因之一為大腦缺血區(qū)域細胞死亡范圍擴大導致的再灌注損傷，而再灌注損傷發(fā)生時間為30 min到72 h不等[20]。因此，在日齡3 d時，HIE患兒在此時的腦損傷程度可能最為嚴重，大腦處在極度缺氧缺血狀態(tài)，成熟的星形膠質細胞大量合成、分泌GFAP，故此時血清GFAP水平最高，且此時神經行為功能低下，致使NBNA評分最低。在經過積極治療后，HIE患兒的缺氧缺血狀態(tài)得到改善，神經元細胞再次得到營養(yǎng)供給，神經系統(tǒng)功能得以恢復，此時的血清GFAP水平有所下降，而NBNA評分也相應上升。

綜上所述，HIE患兒的血清GFAP水平與NBNA評分呈負相關，提示兩個指標可共同作為HIE患兒早期診斷指標并反映其病情嚴重程度，可以指導治療，對降低HIE患兒的病死率有重要意義，從而輔助改善HIE患兒的預后。但本研究只觀察了日齡7 d內的HIE患兒血清GFAP水平及NBNA評分情況，時間較短，對預測HIE患兒預后價值有限，需進一步行隨訪研究。