郭新勸,張云慶
洛陽新區(qū)人民醫(yī)院檢驗科,河南 洛陽 471023
結(jié)節(jié)病是一種原因不明的系統(tǒng)性肉芽腫性疾病,可以累及全身各個器官,以肺結(jié)節(jié)病最為常見[1]。典型的肺結(jié)節(jié)病表現(xiàn)為縱膈及雙肺門淋巴結(jié)腫大,伴或不伴肺內(nèi)陰影,常累及眼部和皮膚,也可有肝臟、心臟、脾臟、骨骼等病變[2]。結(jié)節(jié)病的診斷需要整合多學科綜合判斷,在非干酪樣壞死性上皮樣細胞肉芽腫的病理基礎上,結(jié)合患者的臨床、影像學表現(xiàn),排除其他病因后可確診為結(jié)節(jié)?。?]。大多數(shù)患者預后良好,部分呈自限性病程,約25%的患者表現(xiàn)為慢性、進展性病程,最終導致肺纖維化、肝硬化、失明等。盡管對結(jié)節(jié)病的發(fā)病機制進行了大量研究,結(jié)節(jié)病發(fā)生發(fā)展過程中的特異性標志物及分子調(diào)控有待深入探討。
基于基因芯片或高通量測序平臺的轉(zhuǎn)錄組技術(shù)已被廣泛用于人類疾病生物標志物的篩選。隨著基因芯片和二代測序的應用,產(chǎn)生了大量的生物數(shù)據(jù),其中大部分已經(jīng)上傳至公共數(shù)據(jù)庫中,如腫瘤基因組圖譜TCGA 數(shù)據(jù)庫、基因表達GEO 數(shù)據(jù)庫[4-5]。對于這些數(shù)據(jù)的整合和再分析將為研究提供有價值的線索。本研究從GEO中下載肺結(jié)節(jié)病相關表達譜數(shù)據(jù),篩選結(jié)節(jié)病患者與正常對照之間的差異基因并進行功能分析,以期篩選出肺結(jié)節(jié)病相關的生物標志物,同時預測具有潛在治療結(jié)節(jié)病的藥物,為闡明肺結(jié)節(jié)病發(fā)生的分子機制和開發(fā)靶向治療提供參考依據(jù),現(xiàn)將結(jié)果報告如下。
從GEO 數(shù)據(jù)庫中下載GSE34608 數(shù)據(jù)集,從該數(shù)據(jù)集中選擇36 個血液樣本,包括18 例肺結(jié)節(jié)病患者樣本和18例健康對照樣本[6]。肺結(jié)節(jié)病患者診斷明確,艾滋病、糖尿病、自身免疫性疾病等存在免疫抑制的患者排除在外。提取患者和對照外周血的RNA 樣品,采用GPL6480 芯片平臺,即Agilent-014850人類基因組4x44K G4112F芯片。
1.2.1 差異表達基因篩選 將結(jié)節(jié)病患者樣本和健康對照樣本的表達譜數(shù)據(jù)導入在線工具GEO2R 進行差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)的篩選[7]。采用t 檢 驗 計 算P 值,Benjamini-Hochberg 方 法 對P 值 進 行 校正。DEGs 篩選標準為組間差異倍數(shù)≥2 倍,調(diào)整后,P<0.05。
1.2.2 富集分析 基因本體(Gene ontology,GO)是國際標準化的基因功能分類體系,京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能等信息,以期探索生物系統(tǒng)的高級功能。本研究基于DAVID 數(shù)據(jù)庫進行DEGs 功能模式富集分析[8],包括分子功能富集、生物過程富集和信號通路富集,顯著富集條目的閾值設為P<0.05。
1.2.3 蛋白互作網(wǎng)絡分析 將篩選出的DEGs 上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫獲得蛋白—蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡圖,以綜合得分>0.7 作為顯著性閾值,然后使用Cytoscape軟件進行可視化,采用默認參數(shù)計算PPI網(wǎng)絡中核心基因的度值。
1.2.4 潛在藥物預測 DGIdb 整合了Chembl、DrugBank、PharmGKB等數(shù)據(jù)庫以及PubMed已發(fā)表文獻等信息[9]。將PPI 網(wǎng)絡篩選出的核心基因輸入DGIdb 數(shù)據(jù)庫,篩選與此基因集相互作用的藥物。
以健康對照樣本為對照組,肺結(jié)節(jié)病患者樣本為實驗組,根據(jù)篩選標準,從基因表達譜數(shù)據(jù)中共篩選出2 837個DGEs,其中上調(diào)基因1 662 個,下調(diào)基因1 175 個,部分差異基因,見表1。
表1 差異基因篩選結(jié)果
DGEs 顯著富集的分子功能主要集中在蛋白質(zhì)結(jié)合、信號傳導活性、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)結(jié)合、蛋白激酶活性等。顯著富集的生物過程主要涉及NF-κB 信號、細胞周期阻滯、細胞黏附、免疫反應、蛋白磷酸化、內(nèi)吞、mRNA 加工等,富集水平最顯著的前20個條目列于表2。
表2 GO功能富集分析
DGEs 顯著富集于NF-κB 信號,內(nèi)吞,TNF 信號,
MAPK 信號,趨化因子信號,Toll 樣受體信號,細胞凋亡等,其中富集水平最顯著的前10條通路,見表3。
表3 通路富集分析
將篩選出的DEGs 上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡,該網(wǎng)絡包含1 729個節(jié)點和13 332條邊,PPI富集P值小于1×10-16,平均局部聚類系數(shù)為0.279,采用Cytoscape可視化如圖1A 所示。根據(jù)巨型網(wǎng)絡中的連通度,對DEGs擁有的PPI 對數(shù)量進行統(tǒng)計分析,鑒定出5 個核心節(jié)點基因,包括TLR4、JUN、CASP3、PTEN和CXCL8。
圖1 蛋白相互作用網(wǎng)絡分析
利用DGIdb 數(shù)據(jù)庫在線篩選針對TLR4、 JUN、CASP3、PTEN 和CXCL8 核心基因的藥物共計257 種,包括紫杉醇、秋水仙素、西妥昔單抗、甲巰咪唑等。以“Interaction Score”大于1 為閾值共篩選出潛在藥物29 種,見表4,這些藥物可能與肺結(jié)節(jié)病存在關聯(lián)。
表4 靶基因篩選的潛在治療結(jié)節(jié)病的藥物
結(jié)節(jié)病尚無客觀診斷標準,主要根據(jù)臨床表現(xiàn)、受累部位病理結(jié)果以及影像學特征,排除其他原因后可確診為結(jié)節(jié)?。?]。目前,肺結(jié)節(jié)病尚無特異性的血清診斷標志物。本研究從公共數(shù)據(jù)庫中下載肺結(jié)節(jié)病表達譜數(shù)據(jù),篩選其相關的生物標志物,并對其功能進行挖掘分析。本研究發(fā)現(xiàn)2 837 個基因在肺結(jié)節(jié)病患者和正常對照之間差異表達,富集分析發(fā)現(xiàn),差異基因主要參與信號傳導活性、TNF 結(jié)合、NF-κB 信號、細胞周期阻滯、細胞黏附、免疫反應、蛋白磷酸化等生物過程,主要涉及內(nèi)吞,NF-κB信號,TNF 信號,MAPK 信號,趨化因子信號,Toll 樣受體信號,細胞凋亡等通路。
免疫病理機制在結(jié)節(jié)病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵作用,活動性結(jié)節(jié)病的典型特征是受累組織主要表達干擾素-γ(interferon γ,IFN-γ),同時也高表達白細胞介素2(interleukin 2,IL-2)和TNF-α等細胞因子[10]。TNF-α是形成和維持結(jié)節(jié)病肉芽腫的關鍵細胞因子,靶向TNF-α可以作為結(jié)節(jié)病治療策略之一。有研究發(fā)現(xiàn),結(jié)節(jié)病患者肺組織和血細胞中TLR2 表達升高,單核細胞和巨噬細胞中TNF-α表達增加,并且高表達的TNF-α和IFN-γ誘導肺上皮細胞表達TLR2,表明異常的先天免疫活動可能在肺結(jié)節(jié)病發(fā)病中起主要作用,先天和適應性反應協(xié)同增強肉芽腫反應[11-12]。炎性因子IL-6參與介導多種炎癥和免疫調(diào)節(jié)反應,IL-6 和轉(zhuǎn)化生長因子-βl(transforming growth factor beta l,TGF-β1)是保護性Treg細胞和致病性Th17 細胞增殖分化的調(diào)控因子[13]。當無炎性受損時,IL-6 處于低表達水平,TGF-β1 誘導Treg 細胞增殖,利于免疫耐受。肺結(jié)節(jié)病患者血清中IL-6 和TGF-β1 水平均明顯升高,二者協(xié)同誘導Th17 發(fā)育,使Treg 分化受限,并驅(qū)動Treg 向Th17 轉(zhuǎn)化,提示促炎性Th17 細胞與Treg 細胞之間的平衡對于尋找診斷標志物和針對性藥物具有參考意義[14]。
蛋白互作網(wǎng)絡分析挖掘出的核心基因包括TLR4、JUN、CASP3、PTEN 和CXCL8,參與病原微生物感染、脂多糖反應、炎癥反應、細胞周期與凋亡調(diào)控等。肺結(jié)節(jié)病患者外周血單個核細胞中dectin-1、TLR2和TLR4的基線表達水平較高,真菌細胞壁物質(zhì)和/或脂多糖刺激后,dectin-1、TLR2 和TLR4 的表達減少,增加了外周血單個核細胞的敏感性,導致過度的炎性細胞因子反應,促進肺結(jié)節(jié)病的發(fā)生或進展[15]。針對核心基因篩選出的藥物包括紫杉醇、秋水仙素、西妥昔單抗、甲巰咪唑等,可作為潛在治療藥物。糖皮質(zhì)激素目前仍然是結(jié)節(jié)病治療的一線選擇,當糖皮質(zhì)激素治療失敗或難以耐受毒副作用時,可以選用細胞毒藥物以及抗TNF-α藥物[16]。
綜上所述,本研究對肺結(jié)節(jié)病相關的候選基因進行了篩選,其功能主要涉及TNF和NF-κB信號通路,擴展了對其分子發(fā)生機制的理解,鑒定出的核心基因可能作為肺結(jié)節(jié)病的診斷標志物,也可能作為研發(fā)新型治療藥物的分子靶標。