彭鑫，彭中華，譚奇超，龐河，譚榮雄，蔡杰欽，吳曉慧，魏波，李文慶

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524000； 2.茂名市人民醫(yī)院超聲科，廣東 茂名 525000；3.深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院手足外科，廣東 深圳 518000)

骨不愈合是骨損傷修復(fù)的難點，導(dǎo)致骨不愈合的因素主要包括慢性感染性疾病(如結(jié)核)、惡性侵襲性疾病(如骨腫瘤)、骨折合并軟組織破壞(如大面積開放性骨折)以及患者自身因素(如老年人或免疫功能低下)等[1]。植骨是骨折延遲愈合、不愈合的有效治療手段之一，主要包括患者自體骨移植(如作為皮質(zhì)骨移植物的髂骨移植、帶有血運的腓骨移植)、同種異體骨移植(如脫鈣骨基質(zhì))和骨替代品移植(如磷酸鈣水泥、陶瓷及其復(fù)合物、骨誘導(dǎo)生長因子、生物活性復(fù)合材料)等。其中，作為“金標(biāo)準”的自體骨移植具有取骨部位疼痛、增加感染概率、來源有限等缺點，而同種異體骨移植具有免疫反應(yīng)和疾病傳播的潛在風(fēng)險[2]。因此，骨組織工程學(xué)作為潛在替代方法已成為骨重建的主要策略。生物材料支架是骨組織工程學(xué)的核心，目前3D打印已成為制備生物支架的流行技術(shù)[3]。通過3D打印技術(shù)可打印具有生物兼容性且符合患者特定病灶形態(tài)的復(fù)合支架，不僅在形狀上與缺損骨接近，還可模擬與骨組織相似的孔狀結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性?，F(xiàn)就骨組織工程學(xué)中復(fù)合支架及其應(yīng)用研究進展予以綜述。

1 復(fù)合支架的要求

研究者普遍認為，支架可作為臨時的機械結(jié)構(gòu)用以模仿骨骼組織中的細胞外基質(zhì)[4]，從而加速骨的再生修復(fù)過程。在骨的移植修復(fù)中，常將聚合物和陶瓷作為復(fù)合支架的材料組成。天然骨組織是由羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)和膠原纖維基質(zhì)組成的復(fù)合物，在組織工程應(yīng)用中最常見的復(fù)合材料是結(jié)合了高分子材料與陶瓷材料的復(fù)合材料，如聚合物/陶瓷復(fù)合支架，聚合物可提供良好的彈性強度和抗彎曲性，陶瓷則提供支架的壓縮強度、降解率和成骨能力[5]。因此，陶瓷和生物玻璃礦物被添加到天然和合成聚合物中，如磷酸三鈣(tricalcium phosphatec，TCP)/磷酸四鈣聚合物、β-TCP/生物玻璃、HA/明膠、HA/淀粉、聚己內(nèi)酯(poly caprolactone，PCL)/HA等[6]。一個好的支架需要具備的屬性主要包括：①具有良好的表面滲透性，可轉(zhuǎn)移生物的相關(guān)信號成分，同時還應(yīng)具有一定的機械力學(xué)強度，且最好與天然骨組織相近[7]；②具有合適的孔徑和表面粗糙度，以促進相關(guān)細胞附著或誘導(dǎo)其向成骨方向分化[8]；③具有良好的生物相容性，可最大限度地降低局部毒性和不良免疫/炎癥反應(yīng)的風(fēng)險[9-10]。

2 復(fù)合支架的材料

2.1天然聚合物 多糖、蛋白質(zhì)、淀粉、藻酸鹽、透明質(zhì)酸等均具有天然的生物相容性，且與陶瓷相比質(zhì)地較軟，可適應(yīng)所需形狀的要求；此外，天然聚合物還包含特定的分子結(jié)構(gòu)域，是細胞發(fā)育不同階段發(fā)送重要信號的區(qū)域，可在細胞發(fā)育的各階段支持和引導(dǎo)細胞分泌更多相關(guān)的細胞外基質(zhì)[11]，從而增強支架與組織的生物相互作用。Maciel等[12]用殼聚糖與殼聚糖/纖維蛋白原共聚物分別干預(yù)人巨噬細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用殼聚糖/纖維蛋白原共聚物干預(yù)的巨噬細胞產(chǎn)生了大量重要因子和血管生成介質(zhì)，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-7、成纖維細胞生長因子-7和血小板衍生生長因子-BB等，而這些因子均與骨骼和傷口愈合有關(guān)，由此認為，殼聚糖/纖維蛋白原共聚物可調(diào)節(jié)巨噬細胞對骨重塑及骨再生的反應(yīng)。同時，纖維蛋白還是創(chuàng)面愈合的重要基本成分，具有較強的血管再生性能，是骨再生的重要組成部分[12-13]。Cuadros等[14]制備了海藻酸鈣/明膠多孔支架，該支架除了可改善間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)的黏附和增殖，還可影響MSC分化為成骨細胞和成軟骨細胞譜系的過程。膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的主要成分，具有良好的生物相容性，可用于骨和軟骨支架，而天然聚合物的不足之處在于其可導(dǎo)致嚴重的免疫排斥反應(yīng)或自身攜帶微生物、病毒等造成感染風(fēng)險，同時其穩(wěn)定性較低還會導(dǎo)致降解和分解代謝率較高[15]。

2.2合成聚合物 合成聚合物主要包括聚酯類(如聚乳酸、聚乙醇酸、PCL)和聚乳酸-乙醇酸(polylactic acid-glycolic acid，PLGA)等。合成聚合物合成簡單、成本低，且制造工藝可由實驗室制造擴大至工業(yè)規(guī)模以滿足潛在臨床需求，同時部分商業(yè)化合成聚合物的物理、化學(xué)和機械性能也與天然組織相似[16]。聚乳酸除了具備良好的力學(xué)性能和熱穩(wěn)定性外，還具有生物相容性[10]。Teixeira等[17]制作了涂有Ⅰ型膠原蛋白和聚多巴胺的聚乳酸支架，并研究豬骨髓干細胞對其的反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聚多巴胺+Ⅰ型膠原蛋白在前14 d可促進豬骨髓干細胞細胞外基質(zhì)沉積，在21 d時，豬骨髓干細胞中的堿性磷酸酶表達水平顯著升高，表明聚多巴胺和Ⅰ型膠原蛋白涂層可增強3D打印的聚乳酸支架的骨誘導(dǎo)性。合成聚合物的缺陷主要在于合成聚合物均是疏水的，可導(dǎo)致生物活性降低[18]。Shafiee等[19]選擇聚乙烯醇和PCL制作支架用于兔模型體內(nèi)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型兔的病灶缺損愈合良好。

2.3金屬材料 鈦合金、鈷基合金、鎂合金等金屬材料作為優(yōu)秀候選材料的主要特性是對活細胞良好的生物相容性，這在很大程度上決定了植入物能否成功與骨宿主相結(jié)合[20-21]。與其他金屬植入物相比，多孔鎂和鎂合金的機械性能更接近天然骨[22]。此外，Lino等[23]研究發(fā)現(xiàn)，鍶的二價陽離子可替代HA中的鈣，在骨骼形成過程中起誘導(dǎo)合成代謝和抗分解代謝的作用；該研究中制作的含1%鍶的PCL-富馬酸二異丙酯支架可促進骨組織再生，且未引起局部炎癥反應(yīng)，同時血清鍶水平未升高還可避免引發(fā)心血管反應(yīng)。Rentsch等[24]將三價鉻摻入透鈣磷石形成的磷酸鈣骨水泥并植入大鼠的骨缺損，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新骨組織的形成顯著增加，并可以濃度依賴的方式顯著改善骨吸收和新骨形成，表明加入三價鉻是一種增強磷酸鈣骨水泥細胞相容性的創(chuàng)新方法。金屬材料的缺點在于其不能隨著時間的推移而腐蝕，且釋放的金屬離子可導(dǎo)致感染及其他健康問題等[25]。

2.4無機材料 磷酸鈣、陶瓷、生物活性玻璃或其組合是目前最常用的合成骨替代物，該類骨替代物具有合適的剛度、優(yōu)異的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性以及耐化學(xué)腐蝕特性，可促進生物礦化[26]。如Oliveira等[27]將高互通性大孔HA支架接種于大鼠骨髓基質(zhì)細胞，結(jié)果顯示細胞黏附與增殖情況均較好，且具有一定活力。此外，多種無機材料也可組合成復(fù)合無機材料，如HA/TCP。而生物材料另一重點研究領(lǐng)域是β-TCP，常見的組合方式是不同比例的較穩(wěn)定部分HA與易溶部分β-TCP組合，其中HA具有良好的機械性能，β-TCP除了具有骨傳導(dǎo)性，還有骨誘導(dǎo)性及安全性，這種組合可提高材料本身的生物活性和生物降解率，在保證生物材料穩(wěn)定性的同時促進骨生長。研究發(fā)現(xiàn)，與其他比例(76/24、63/37、56/44)HA/β-TCP、純HA和純β-TCP支架相比，種植人MSC的HA/β-TCP(20/80)支架具有最高的成骨速率[28]。但目前只有HA/β-TCP(65/35)、HA/β-TCP(60/40)和HA/β-TCP(50/50)在人體臨床試驗中成功應(yīng)用[29]。此外，無機材料還可與有機聚合物組成復(fù)合材料，如PLGA/TCP、PCL/TCP和PLGA/HA等。有研究通過低溫3D打印技術(shù)，以PLGA/TCP復(fù)合材料為載體，將多種骨誘導(dǎo)活性分子(淫羊藿素、淫羊藿苷、丹酚酸B、金屬鎂等)融入PLGA/TCP生物墨水，構(gòu)建促進骨再生多孔材料，結(jié)果顯示PLGA/TCP可作為低溫3D打印的理想生物墨水，用于負載多種骨誘導(dǎo)活性分子，促進骨缺損再生[30-33]。目前的3D打印技術(shù)已經(jīng)開發(fā)出具有復(fù)雜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的HA支架，細胞可擴散至支架深層而不會發(fā)生堵塞。因此，HA是適用于骨重建的有前途的生物材料。近年，生物活性玻璃的研究重心已轉(zhuǎn)移至介孔生物活性玻璃(mesoporous bioactive glass，MBG)。結(jié)合3D技術(shù)，使用聚乙烯醇作為黏合劑制作的多功能MBG的機械強度較傳統(tǒng)MBG顯著升高[34]。Wu等[35]將MBG/絲綢支架植入小鼠的顱蓋缺損中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與純絲綢支架和非MBG/絲綢支架相比，MBG/絲綢支架Ⅰ型膠原蛋白的表達和新骨形成均顯著增加。但MBG脆弱易碎、機械強度低，限制了其在骨組織工程學(xué)中的應(yīng)用。將MBG與生物聚合物(如PCL)結(jié)合可提高機械強度。Yun等[36]提出，可在MBG/PCL支架上進行細胞外基質(zhì)組分預(yù)涂，使其具有足夠的機械性能和良好的3D互聯(lián)孔結(jié)構(gòu)。

3 用于骨組織工程的生物活性因子或細胞

3.1生長因子在組織工程中的應(yīng)用 在組織工程學(xué)中，可將生長因子與可生物降解載體結(jié)合，載體可提供一定的機械強度，而生長因子的持續(xù)緩釋可增加其在生物體內(nèi)的濃度，刺激細胞的黏附、增殖和分化，促進骨和軟骨的再生，同時還可避免全身性使用的不可預(yù)測后果，如缺乏長期穩(wěn)定性、劑量依賴性所導(dǎo)致的致癌性等。有研究提出，可將復(fù)合支架與成骨細胞、生長因子或骨形成蛋白結(jié)合形成新的傳遞載體[37]。BMP作為重要的內(nèi)源性骨誘導(dǎo)因子之一可誘導(dǎo)成骨反應(yīng)和骨形成，其中BMP-2和BMP-7是骨髓MSC(bone marrow MSC，BMSC)骨分化過程中的有效刺激因子[38]。Wang等[39]制作了結(jié)合基因工程的3D打印雙功能支架，實現(xiàn)了在多西環(huán)素介導(dǎo)下釋放BMP-2；進一步研究顯示，多西環(huán)素介導(dǎo)釋放的BMP-2可導(dǎo)致成骨細胞分化能力、誘導(dǎo)骨組織形成能力均顯著增強；同時，多西環(huán)素還具有廣譜抗菌能力，可防止感染的發(fā)生，并可修復(fù)感染性骨缺損。此外，轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)、成纖維細胞生長因子等特定信號分子也可促進組織生長。Chen等[40]研究發(fā)現(xiàn)，衰老可損害BMSC對IGF-1的促有絲分裂活性和成骨潛能，研究者將過表達IGF-1的衰老BMSC接種到海藻酸鈣支架，結(jié)果發(fā)現(xiàn)衰老的BMSC中的IGF-1過表達可促進支架中的細胞簇形成，導(dǎo)致細胞簇內(nèi)部的細胞存活率增加，從而誘導(dǎo)成骨細胞標(biāo)志物的表達，增強細胞簇的生物礦化作用，表明IGF-1過表達可增強細胞的成骨能力。Lee等[41]將聚多巴胺和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)直接移植到支架表面以誘導(dǎo)有效血管生成過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對血管生成十分重要的CD31的表達增加，原因在于VEGF與VEGF受體2結(jié)合可增加VEGF受體2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致VEGF的血管生成活性增強。BMP-2、VEGF和堿性成纖維細胞生長因子之間的組合還會對人臍靜脈內(nèi)皮細胞血管生成過程產(chǎn)生協(xié)同促進作用，在血管活化初期階段添加成纖維細胞生長因子-2與VEGF、在血管成熟階段添加BMP-2，均可產(chǎn)生更強的體內(nèi)外血管生成反應(yīng)[42]。

3.2細胞在組織工程中的應(yīng)用 由于骨骼與軟骨組織具有獨特的組織生長機制、物質(zhì)代謝和不同成分，目前開發(fā)的骨-軟骨雙層復(fù)合支架即是利用不同材料之間的優(yōu)點促進骨軟骨細胞的生成。骨-軟骨雙層支架不是在單一結(jié)構(gòu)中恢復(fù)骨和軟骨的功能，而是模仿不同組織的天然細胞外基質(zhì)。有研究者提出，可將成骨細胞與軟骨細胞共培養(yǎng)，然后再移植到支架中以模擬功能化的軟骨-骨界面，從而促進成骨細胞與軟骨細胞的生長和分化[43]。Wu等[44]制作了軟骨細胞/成骨細胞負載的β-TCP生物陶瓷支架和軟骨細胞負載的β-TCP生物陶瓷支架，并用于小獵犬關(guān)節(jié)軟骨缺損的治療，結(jié)果顯示，軟骨細胞/成骨細胞負載的β-TCP生物陶瓷支架的股骨滑車相對軟骨再生能力>軟骨細胞復(fù)合β-TCP生物陶瓷支架>β-TCP生物陶瓷復(fù)合支架。目前，雙層支架主要包括3種類型：①單一不均勻支架，將軟骨組織或軟骨細胞直接種植于骨支架基底上的新骨組織；②組合式雙層支架，將兩種不同的軟骨支架和骨支架連接組裝在一起；③一體化雙層支架，將兩個不同部分組成的雙層支架通過共有的共同材料融合在一起[45]。MSC也是骨組織工程學(xué)中的良好應(yīng)用材料，其具有分化為多種不同結(jié)締組織(如軟骨、骨骼、肌肉和肌腱組織)的能力[46]。BMSC作為多能干細胞可分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞，因此可應(yīng)用BMSC提高關(guān)節(jié)炎中軟骨缺陷的內(nèi)在修復(fù)潛能[47]。

4 復(fù)合支架的孔徑設(shè)計

天然骨組織是孔隙率為50%～90%、孔徑為1 mm的多孔環(huán)境[48]。相關(guān)研究證明，支架的孔結(jié)構(gòu)是細胞分化、增殖以及新組織再生的重要因素[49-51]?？组g連接是重要參數(shù)，其可在沒有血液供應(yīng)的情況下，幫助運輸氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物，同時還可作為血管的形成途徑，為了獲得良好的孔間流動性，建議孔間連接應(yīng)為15～50 μm[52]。同時，骨組織工程支架的孔徑率和孔徑大小也會影響細胞的生長發(fā)育、附著以及生物降解和藥物釋放速率，因為孔徑率和孔徑大小可決定支架的表面積[53]?？讖綔p小可增加支架的表面積，從而促進細胞的相互結(jié)合以及細胞與支架表面的相互作用。若孔徑太小，細胞可能難以遷移至支架結(jié)構(gòu)中，因此支架的孔徑大小應(yīng)有利于細胞反應(yīng)過程。骨形成中，細胞生長的孔徑為100～150 μm，而血管形成中則要求孔徑>300 μm[54-55]。目前，骨組織工程中開發(fā)的主要支架見表1。

表1 骨組織工程中開發(fā)的支架

5 小 結(jié)

骨缺損的修復(fù)過程復(fù)雜且困難，因此作為替代傳統(tǒng)骨重建方法的骨組織工程學(xué)中的骨修復(fù)材料的選擇十分重要。骨組織工程學(xué)復(fù)合支架的物理和化學(xué)特性、支架的設(shè)計方案以及材料之間的相互作用均可影響細胞誘導(dǎo)分化的作用。因此，未來還需要進一步在動物模型中進行體內(nèi)研究，根據(jù)骨缺損修復(fù)的情況研究支架的整合能力、骨骼中的血管形成、可能出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)以及在生物體內(nèi)的長期穩(wěn)定性，并更好地將實驗室數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為臨床相關(guān)策略，為骨缺損的修復(fù)提供新思路。