◎ 楊玉瓊，李 遙，魏劭恒，李佳俐，唐順之，許文東

（廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司 中藥制藥過(guò)程技術(shù)與新藥創(chuàng)制國(guó)家工程研究中心 廣東省藥用脂質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510240）

初榨橄欖油是木本科油料作物油橄欖樹(shù)的成熟果實(shí)經(jīng)過(guò)冷榨提取得到的油品，富含多酚、生育酚、角鯊烯和甾醇等多種微量營(yíng)養(yǎng)成分，油酸含量高達(dá)55%～83%，食用橄欖油可預(yù)防心血管疾病、改善炎癥和腸道菌群[1-3]。油橄欖樹(shù)原生長(zhǎng)于希臘、西班牙、意大利等地中海沿岸國(guó)家，在1964年經(jīng)周恩來(lái)總理從阿爾巴尼亞引種至國(guó)內(nèi)[4]。經(jīng)過(guò)多年的試種和栽培，至今在我國(guó)甘肅隴南、四川廣元、云南昆明、陜西城固和湖北宜昌等地區(qū)形成多個(gè)油橄欖適生區(qū)[5]。初榨橄欖油的生產(chǎn)是以新鮮采摘的油橄欖果為原料，采用先進(jìn)的成套連續(xù)生產(chǎn)設(shè)備分離得到鮮榨橄欖油，最終經(jīng)靜置沉淀去除多余水分和雜質(zhì)后得到可供食用的初榨橄欖油。國(guó)外有研究報(bào)道，在剛生產(chǎn)出來(lái)而未經(jīng)沉淀的呈渾濁狀態(tài)的初榨橄欖油中，蛋白質(zhì)含量只有0.05～2.40 mg·kg-1，磷含量只有0.8～4.8 mg·kg-1（相當(dāng)于磷脂含量為21～124 mg·kg-1），而在經(jīng)過(guò)濾之后以及市售的初榨橄欖油和精煉橄欖油中，蛋白質(zhì)和磷脂含量都明顯降低[6]。這是由于初榨橄欖油生產(chǎn)工藝的獨(dú)特性，油橄欖果中的蛋白質(zhì)、磷脂等膠質(zhì)成分在分離和沉淀過(guò)程中被除去，類(lèi)似于油脂精煉過(guò)程的水化脫膠工序，最終使得在成品初榨橄欖油中殘留極少的膠質(zhì)成分[7]。由于橄欖油中磷脂含量較低，本研究通過(guò)對(duì)推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《糧油檢驗(yàn) 磷脂含量的測(cè)定》（GB/T 5537—2008）[8]中的鉬藍(lán)比色法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，測(cè)定了國(guó)產(chǎn)橄欖油中真實(shí)的磷脂含量，為深入研究國(guó)產(chǎn)橄欖油的微量成分以及國(guó)產(chǎn)橄欖油的綜合利用開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氧化鋅（化工級(jí)，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；鹽酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；氫氧化鉀、鉬酸鈉和硫酸聯(lián)氨（均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；硫酸（分析純，珠海市華成達(dá)化工有限公司）；磷酸二氫鉀對(duì)照品（含量100.0%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；初榨橄欖油（特級(jí)，產(chǎn)自四川廣元）；精煉橄欖油（自制）。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（BSA224S-CW型，德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU-1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、馬弗爐（SGM28型，洛陽(yáng)市西格馬儀器制造有限公司）、電爐（ST3006型，廣東尚朋堂電器有限公司）、水浴鍋（HH-6型，常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 方法依據(jù)

依據(jù)《糧油檢驗(yàn) 磷脂含量的測(cè)定》（GB/T 5537— 2008）中的鉬藍(lán)比色法進(jìn)行橄欖油中磷脂含量方法驗(yàn)證和測(cè)定。

1.3.2 溶液配制

鹽酸溶液：取鹽酸50 mL，溶解于50 mL水中即得。5%鉬酸鈉稀硫酸溶液：量取140 mL濃硫酸，注入300 mL水中，冷卻至室溫，加入12.5 g鉬酸鈉，溶解后用水定容至500 mL，充分搖勻，靜置24 h備用。0.015%硫酸聯(lián)氨溶液：取硫酸聯(lián)氨0.15 g，溶解于 1 L水中即得。氫氧化鉀溶液：取50 g氫氧化鉀溶解在50 mL水中即得。對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取磷酸二氫鉀0.439 3 g，至100 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻；再精密量取1mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，即得每1 mL含磷10 μg的標(biāo)準(zhǔn)磷溶液。供試品溶液：取供試品10 g，加氧化鋅0.5 g，先在電爐上緩慢加熱至樣品變稠，逐漸加熱至全部炭化，將坩堝送至550～600 ℃的馬弗爐中灼燒至完全灰化（白色），時(shí)間約為2 h。放冷，加鹽酸溶液10 mL，煮沸 5 min至殘?jiān)芙?，將溶解液過(guò)濾注入100 mL量瓶中，每次用大約5 mL熱水沖洗坩堝和濾紙3～4次，待濾液冷卻至室溫后，用氫氧化鉀溶液中和至出現(xiàn)渾濁，緩慢滴加鹽酸溶液使氧化鋅沉淀全部溶解，再加2滴，最后用水稀釋至刻度，搖勻。同時(shí)制備一份 樣品空白。

1.3.3 測(cè)定

精密量取標(biāo)準(zhǔn)磷溶液0 mL、1 mL、2 mL、4 mL、6 mL和8 mL，分別置50 mL比色管中，各補(bǔ)加水至10 mL，分別加0.015%硫酸聯(lián)氨溶液8 mL，加2.5%鉬酸鈉稀硫酸溶液2 mL，加塞，振搖3～4次，去塞，將比色管放入沸水浴中加熱10 min，取出放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置10 min。用試劑空白調(diào)整零點(diǎn)，在650 nm處分別測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，含磷量為橫坐標(biāo)（10 μg、20 μg、40 μg、60 μg和80 μg）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

另精密量取供試品溶液10 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下自“分別加入0.015%硫酸聯(lián)氨溶液8 mL”起同法操作，用樣品空白調(diào)整零點(diǎn)，測(cè)定其吸光度，由回歸方程計(jì)算含磷量，即得。

1.3.4 計(jì)算

供試品中的磷脂含量以磷含量表示（供試品磷脂含量為供試品磷含量乘以系數(shù)26.31），按下式計(jì)算：

式中：X表示供試品中磷含量，mg·kg-1；P表示從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的供試品溶液的含磷量，μg；m表示供試品重量，g；V1表示供試品灰化后稀釋的體積，100 mL；V2表示測(cè)定時(shí)量取供試品溶液體積，10 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 專(zhuān)屬性

分別取樣品空白溶液、供試品溶液和對(duì)照品溶液在400～800 nm進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，記錄光譜圖（圖1）。結(jié)果顯示，供試品溶液與對(duì)照品溶液光譜吸收基本一致，空白溶液無(wú)干擾，說(shuō)明本方法測(cè)定橄欖油中磷脂含量的專(zhuān)屬性良好。

圖1 專(zhuān)屬性光譜圖

2.2 線性和范圍

取對(duì)照品溶液依法操作，在650 nm處分別測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，含磷量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算回歸方程。不同含磷量對(duì)應(yīng)的吸光度如表1所示，結(jié)果顯示本方法在10～80 μg線性關(guān)系良好，能滿足橄欖油磷脂含量測(cè)定的要求。

表1 線性和范圍表

2.3 檢測(cè)限和定量限

制備11份樣品空白溶液，依法操作，用試劑空白調(diào)整零點(diǎn)，測(cè)定吸光度，按照基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法計(jì)算儀器檢測(cè)限（Limit of Detection， LOD）和定量限（Limit of Quantitation，LOQ）。 LOD=3.3δ/S，LOQ=10δ/S，δ為空白響應(yīng)值的偏差，S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。儀器檢測(cè)限和定量限如表2所示。本方法檢測(cè)限和定量限分別為0.42 mg·kg-1和1.28 mg·kg-1。

2.4 精密度

2.4.1 重復(fù)性

取供試品10 g共6份，分別加入1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)磷溶液0.1 mL，制成加標(biāo)供試品，按照“1.3.2 溶液配制”制備成供試品溶液，并按照“1.3.3 測(cè)定”依法操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算磷含量。如表3所示，加標(biāo)供試品重復(fù)性RSD小于6%，說(shuō)明本方法重復(fù)性良好。

表2 檢測(cè)限和定量限表

表3 加標(biāo)供試品重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表

2.4.2 中間精密度

另制備6份加標(biāo)供試品，在不同時(shí)間由不同人員依法操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算磷含量，與重復(fù)性數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析。如表4所示，中間精密度RSD小于6%，說(shuō)明本方法中間精密度良好。

表4 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果表

2.5 準(zhǔn)確度

按照80%、100%、120%加標(biāo)，制備9份加標(biāo)供試品溶液，依法操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算磷含量。準(zhǔn)確度回收率試驗(yàn)結(jié)果如表5所示，平均回收率在80%～115%，RSD小于6%，說(shuō)明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.6 耐用性

2.6.1 溶液穩(wěn)定性

取加標(biāo)供試品溶液5份，分別于室溫放置0 h、1 h、 2 h、4 h和8 h后依法操作，測(cè)定吸光度。溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果如表6所示，溶液在8 h內(nèi)測(cè)定的吸光度RSD小于6%，說(shuō)明供試品溶液在8 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定性較好。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果表

表6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表

2.6.2 硫酸聯(lián)氨溶液用量考察

取加標(biāo)供試品溶液5份，分別加入0.015%硫酸聯(lián)氨溶液7.0 mL、7.5 mL、8.0 mL、8.5 mL和9.0 mL，后續(xù)依法操作，測(cè)定其吸光度。硫酸聯(lián)氨溶液用量考察結(jié)果如表7所示，吸光度RSD小于6%，說(shuō)明硫酸聯(lián)氨溶液用量在7.0～9.0 mL對(duì)吸光度測(cè)定影響較小。

表7 硫酸聯(lián)氨溶液用量考察結(jié)果表

2.6.3 鉬酸鈉溶液用量考察

取加標(biāo)供試品溶液5份，分別加入0.015%硫酸聯(lián)氨溶液8 mL，再分別加2.5%鉬酸鈉稀硫酸溶液 1.6 mL、1.8 mL、2.0 mL、2.2 mL和2.4 mL，后續(xù)依法操作，測(cè)定其吸光度。鉬酸鈉溶液用量考察結(jié)果如表8所示，吸光度RSD小于6%，說(shuō)明鉬酸鈉溶液用量在1.6～2.4 mL對(duì)吸光度測(cè)定影響較小。

2.7 橄欖油中磷脂含量測(cè)定

取3批初榨橄欖油和3批精制橄欖油樣品按驗(yàn)證后的磷脂含量測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表9所示。國(guó)產(chǎn)初榨橄欖油的磷含量為4.57～5.27 mg·kg-1（磷脂含量為120～139 mg·kg-1），高于國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道（經(jīng)沉淀后初榨橄欖油磷含量1.0～1.4 mg·kg-1）[6]，經(jīng)過(guò)精煉后橄欖油的磷含量則進(jìn)一步降低。

表8 鉬酸鈉溶液用量考察結(jié)果表

表9 橄欖油樣品中磷脂含量測(cè)定結(jié)果表

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)《糧油檢驗(yàn) 磷脂含量的測(cè)定》（GB/T 5537— 2008）中的鉬藍(lán)比色法的方法學(xué)研究表明，檢測(cè)限和定量限、線性和范圍、精密度、準(zhǔn)確度以及耐用性均符合方法學(xué)要求，能滿足橄欖油中低磷脂含量的測(cè)定。同時(shí)測(cè)定結(jié)果表明國(guó)產(chǎn)初榨橄欖油的磷脂含量較低，雖然高于國(guó)外初榨橄欖油磷脂含量水平，但要低于傳統(tǒng)脫膠精煉油的要求（磷含量在5～10 mg·kg-1）[9]。