張惠惠，崔議方，宋書祎，蘭先明，張中磊，李悅，張穩(wěn)穩(wěn)*，張加余*

(1.煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東 煙臺 264003； 2.濱州醫(yī)學院藥學院，山東 煙臺 264003)

松花粉為松科植物馬尾松、油松或同屬植物的干燥花粉，營養(yǎng)成分豐富，早在《神農本草經》中就已被記載，被認為“甘、溫、無毒”，有“潤心肺、益氣、祛風止血、壯顏益志”的功效，是祖國醫(yī)藥學寶庫中僅有的食藥兼用花粉品種[1]，但是源自自然界的松花粉不可避免的會攜帶各種微生物，因此，對松花粉進行滅菌十分必要。目前，食品滅菌的方法有多種，應用最廣的是輻照滅菌，其可在保證滅菌效果的基礎上，能較好地保存花粉的營養(yǎng)成分[2]。一般來說，一定劑量內輻照滅菌食品是安全的，但仍有部分消費者不認可輻照食品。同時，隨著消費者對食品安全衛(wèi)生性能要求的提高，食品制造企業(yè)對微生物管理的要求也越來越嚴格[3]。

過熱蒸汽是對飽和蒸汽繼續(xù)加熱，在相同壓力下溫度高于沸點的水蒸氣，采用過熱蒸汽滅菌能夠使物料受熱更均勻，傳熱更快，有效滅殺食品中的微生物及芽孢[4]。本文通過對過熱蒸汽滅菌松花粉進行急性經口毒性試驗、細菌回復突變(Ames)試驗、哺乳動物紅細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗及大鼠28 d經口毒性試驗等毒理學評價試驗研究，旨在為過熱蒸汽滅菌松花粉及其產品開發(fā)提供毒理學安全性評價實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 受試物 過熱蒸汽滅菌松花粉(煙臺新時代健康產業(yè)有限公司，過熱蒸汽滅菌工藝：145～165 ℃，壓力0.2～0.3 Mpa，4～6 s)，產品批號為1640512-1。

1.2 實驗動物 SD大鼠和ICR小鼠均由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，許可證號：SCXK(魯)20140007。

1.3 菌株及S9 細菌回復突變試驗選用經鑒定符合要求的菌株，均購自美國Moltox公司，其中S9批號：2895；TA1535批號：4694D；TA100批號：4678D；TA102批號：4677D；TA97a批號：4689D；TA98批號：4689D。

1.4 試劑試藥與主要儀器 環(huán)磷酰胺(Sigma-Aldrich公司，批號：WXBC2421V)；AMES陽性對照藥物：4-硝基喹啉氮氧化物(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：N113910)；疊氮鈉(Amresco公司，批號：0639)；絲裂霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：131101)； 2-氨基芴(上海晶純試劑有限公司，批號：13152)。

SW-CJ-2F雙人雙面超凈工作臺；MCO-20AIC恒溫培養(yǎng)箱；DHG-9203A電熱恒溫干燥箱；DK-8D電子恒溫水浴鍋；HV-50高壓滅菌器；Milli-Q IQ7000純水儀；NanoDrop One C超微量分光光度計；Supcre G9全自動菌落計數(shù)分析儀；Sysmex XN-1000全自動模塊式血液體液分析儀；Roche cobas c 311全自動生化分析儀。

2 實驗方法

2.1 急性經口毒性試驗 參照GB15193.3-2014，按照限量法設10 g·(kg·BW)-1劑量組。取SPF級ICR小鼠16只，體重18～22 g，雌雄各半，按照10 mL·(kg·BW)-1的灌胃容量灌胃0.5 g·mL-1的供試品混懸液2次，間隔4 h，連續(xù)觀察14 d，觀察動物的中毒表現(xiàn)和死亡情況。

2.2 細菌回復突變試驗 參照GB15193.4-2014，采用平板摻入法，使用鑒定合格的鼠傷寒沙門氏菌突變型菌TA1535、TA100、TA102、TA97a、TA98五個菌株進行試驗。試驗設置5 000、2 500、1 250、625、312.5 μg/皿5個受試物劑量，另設空白對照組與陽性對照組，每個劑量做3個平行皿，整套試驗在相同條件下重復做2次并分別統(tǒng)計。

2.3 小鼠精子畸形試驗 參照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》(2003年版)，設置2.5、5和10 g·(kg·BW)-13個口服劑量組和環(huán)磷酰胺陽性對照組40 mg·(kg·BW)-1及陰性對照組，每組動物10只，通過口腔灌胃每24 h給藥1次，連續(xù)給藥5 d。末次給藥后30 d 處死小鼠，取附睪制片，伊紅染色，每只小鼠為一觀察單位，計數(shù)1 000條完整的精子中畸形精子數(shù)，計算各組小鼠精子畸變率。

2.4 哺乳動物紅細胞微核試驗 參照GB15193.5-2014，設置2.5、5和10 g·(kg·BW)-13個口服劑量組，另設溶媒對照組、陽性對照組(腹腔注射給予40 mg·kg-1的環(huán)磷酰胺)，每組動物10只，通過口腔灌胃每24 h給藥1次，連續(xù)給藥2次，末次給藥后約18～24 h內，取股骨骨髓涂片，甲醇固定，Giemsa染色，在光學顯微鏡下，每只小鼠計數(shù)2 000個嗜多染紅細胞，并記錄微核發(fā)生率(‰)，同時計數(shù)200個骨髓紅細胞[嗜多染紅細胞(PCE)加正染紅細胞(NCE)]，求出嗜多染紅細胞/總紅細胞的比值，即PCE/(PCE+NCE)的比值。如出現(xiàn)明顯的劑量-反應關系，并有統(tǒng)計學意義，即確認為陽性結果。

2.5 28 d經口毒性試驗 設5、2.5、1.25 g·(kg·BW)-13個劑量組和1個溶媒對照組，每組動物16只，雌雄各半。分籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，連續(xù)灌胃28 d后試驗結束。處死大鼠，觀察血常規(guī)、血清生化學指標和病理檢查。病理組織學檢查時先對高劑量組和對照組動物的主要臟器進行，如果發(fā)現(xiàn)病變后需對較低劑量組相應的器官及組織制片檢查。

2.6 統(tǒng)計分析 應用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據統(tǒng)計與分析，各組動物的微核率及 PCE/(PCE+NCE)比值采用均數(shù)±標準差描述；精子畸形實驗陽性的判斷標準是精子畸形發(fā)生率至少為陰性對照組的兩倍或經統(tǒng)計學處理差異有統(tǒng)計學意義，并存在劑量-反應關系者，或者至少應該有兩個相鄰劑量組的精子畸形率達到陰性對照組的兩倍或經檢驗差異具有統(tǒng)計學意義。大鼠28 d喂養(yǎng)實驗數(shù)據同樣采用均值±標準差描述。組間比較采用組間比較t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 小鼠急性毒性試驗 以10 g·(kg·BW)-1劑量連續(xù)灌胃后觀察14 d，小鼠存活率100%，且無明顯異常狀態(tài)。依據急性毒性分集評價標準判定，該受試物對小鼠LD50>5 g·(kg·BW)-1，屬于實際無毒級。

3.2 細菌回復突變試驗 在本試驗條件下，各菌株自發(fā)回變菌落數(shù)(溶劑對照)在實驗室正常范圍內，陽性對照回變菌落數(shù)均明顯高于溶劑對照(回變菌落數(shù)是溶劑對照2倍以上，且差異有統(tǒng)計學意義)，提示試驗體系可靠。抑菌試驗表明，松花粉樣品濃度達5 000 μg/皿時，對所有菌株(TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535)均無抑菌作用。試驗用此濃度作為最高濃度，結果表明細菌生長背景良好。不同濃度松花粉樣品(5 000、2 500、1 250、625、312.5 μg/皿)，對所有測試的菌株無論在無S9代謝活化系統(tǒng)的直接作用還是經S9代謝活化系統(tǒng)作用后均未引起回變菌落數(shù)的增加(見表1～2)。

表1 Ames試驗結果

表2 Ames試驗結果

3.3 哺乳動物紅細胞微核試驗 受試物各劑量組與陰性對照組的微核發(fā)生率在0.6‰～1.3‰之間，環(huán)磷酰胺陽性對照組的微核發(fā)生率為雌性小鼠34.20‰，雄性小鼠27.20‰。各劑量組骨髓細胞微核率與陰性對照組相比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而陰性對照組與環(huán)磷酰胺陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示未見該受試物哺乳動物紅細胞微核試驗結果為陰性。

3.4 小鼠精子畸形試驗 受試物各劑量組與陰性對照組的小鼠精子畸形率在3.98%～4.10%之間，環(huán)磷酰胺陽性對照組為8.71%，各劑量組動物精子畸形率與陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而陰性對照組與環(huán)磷酰胺陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示未見該受試物對雄性小鼠的精子產生致突變作用。

3.5 28 d經口毒性試驗 試驗期間各組動物未見明顯中毒表現(xiàn)，大鼠生長發(fā)育良好，試驗結束時，無動物死亡。各劑量組動物體重、體重增加與對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)；血液學指標、血生化指標、臟器絕對重量及臟/體比值與對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)；病理組織學檢查，各劑量組大鼠的臟器未發(fā)現(xiàn)異常，臟器系數(shù)與對照組比較未見明顯統(tǒng)計學差異，提示該受試物對大鼠的臟器組織無損害作用(見表3～5)。

表3 松花粉對動物體重的影響

表4 松花粉對血液學指標的影響

表5 松花粉對血生化指標的影響

4 討論

松花粉是一味歷史悠久的藥食同用類中藥，曾有記載稱松花粉在春季采集，稟天春和之木氣，得地中正之土味，歸足厥陰肝、足太陰脾二經，有益肝之陽氣及脾之陰氣，具有散肝除風、和脾止血的功效[17]?，F(xiàn)代藥理研究表明，松花粉具有抗氧化、促進細胞增殖與傷口愈合、調節(jié)免疫、抗化學性肝損傷等功效。為了除去松花粉中攜帶的微生物，本實驗以食品滅菌中常用的加工手段過熱蒸汽滅菌法為滅菌方法進行處理。其基本原理依據是常用的加熱殺菌法食品工藝技術，在加壓的情況下，對飽和蒸汽再進行加熱以后形成的水蒸氣，在一定的設備設施中與待滅菌物料接觸，從而達到物料滅菌的效果，并避免物料結塊、風味損失等一系列問題。過熱蒸汽滅菌法可用于香味料、蕎麥粉、可可豆和谷類等的滅菌處理。大量實驗表明，過熱蒸汽不僅殺菌效果好，而且熱敏性物質的保存率較高。例如，高速攪拌式過熱蒸汽殺菌法用于小麥粉等的殺菌[22]，能有效降低小麥粉中微生物含量，并且能較好維持小麥粉結構特性，顆粒形態(tài)完整，雙折射強度幾乎沒有變化；塔式過熱蒸汽殺菌法也常被用于處理冷凍干燥蔬菜制品，能最大限度地保存色、香、味及其營養(yǎng)成分[23]。

食品安全關系民生，食品安全性毒理學評價是食品安全食用與開發(fā)的前提。松花粉作為重要的食用藥用資源及中藥保健食品的開發(fā)原料，對其產品的安全性毒理學評價顯得尤為重要。本研究表明，過熱蒸汽滅菌松花粉最大給藥劑量達10 g·(kg·BW)-1下，未見動物有中毒癥狀和死亡，急性經口毒性屬于實際無毒級。細菌回復突變試驗、哺乳動物紅細胞微核試驗、小鼠精子畸形3項遺傳毒性組合試驗結果均為陰性，表明過熱蒸汽滅菌松花粉無致突變作用。28 d經口毒性試驗 結果表明，動物生長發(fā)育正常，體重持續(xù)增長正常，行為無異常，無中毒及死亡癥狀，血常規(guī)和血液生化等指標等均未受明顯影響，且經組織病理學檢查均未見與受試物作用有關的病理學改變，提示該過熱蒸汽滅菌松花粉未見毒性作用。

綜上所述，上述試驗結果均表明過熱蒸汽滅菌松花粉并無明顯毒性作用，安全性較高。本研究可為松花粉滅菌工藝優(yōu)選以及松花粉的進一步開發(fā)利用提供一定依據。