倪小龍，吳金凱，陸雪梅，梅 婕，張溫清，周 萍

（1.宣城市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽宣城 242000；2.安徽宣酒集團(tuán)股份有限公司科研技術(shù)中心，安徽宣城 242000）

白酒，中國(guó)傳統(tǒng)的文化飲品，是老百姓餐桌上不可或缺的一部分，每年的生產(chǎn)量、消費(fèi)量都很大，因此白酒也是日常監(jiān)督抽檢重點(diǎn)食品之一。白酒在異常發(fā)酵釀造的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些苦味物質(zhì)，影響口感，而部分小作坊為了掩蓋此缺陷違規(guī)添加甜味劑，以次充好，因此歷年來(lái)國(guó)家或省地區(qū)白酒抽檢中，甜味劑檢出屢見(jiàn)不鮮[1]?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[2]中對(duì)甜味劑的使用有著嚴(yán)格的規(guī)定，純糧固態(tài)發(fā)酵的白酒中不允許添加，因此檢測(cè)白酒中甜味劑對(duì)白酒質(zhì)量日常監(jiān)管和自身企業(yè)質(zhì)量控制都有重大意義?，F(xiàn)階段白酒甜味劑檢測(cè)國(guó)標(biāo)方法多為單一種類檢測(cè)，如《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定》（GB 5009.97—2016）[3]采用的是超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法，而在實(shí)際檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，該方法在低濃度檢測(cè)時(shí)存在基質(zhì)干擾，且其采用的是正負(fù)離子同時(shí)掃描，正離子響應(yīng)較低，不能準(zhǔn)確定性，容易出現(xiàn)漏判、誤判。三氯蔗糖目前按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測(cè)定》（GB 22255—2014）[4]檢測(cè)，但因其檢測(cè)靈敏度太低，在低濃度范圍，該方法無(wú)法使用。出入境檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)《出口食品中六種合成甜味劑的檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（SN/T 3538—2013）[5]采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)檢測(cè)6 種甜味劑，但其檢測(cè)范圍不包含白酒，而且甜蜜素也只提供一個(gè)離子對(duì)，不符合質(zhì)譜檢測(cè)定性要求等問(wèn)題。愛(ài)得萬(wàn)甜、麥芽糖醇目前尚未見(jiàn)白酒中的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法。本研究旨在使用超高效液相色譜三重四極桿與離子阱聯(lián)用（Ultra Performance Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Composite Linear Ion Trap Mass Spectrometry，UPLC-QTRAP）技術(shù)一步法同時(shí)檢測(cè)白酒中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、紐甜、阿力甜、三氯蔗糖、麥芽糖醇及愛(ài)得萬(wàn)甜9 種常見(jiàn)甜味劑，在保證定量準(zhǔn)確性的同時(shí)，減少檢測(cè)假陽(yáng)性率，為白酒監(jiān)管以及白酒質(zhì)量控制提供有效技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、阿力甜、紐甜、阿斯巴甜液體標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自于北京壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)品有限公司；麥芽糖醇（純度99.0%）、三氯蔗糖（純度99.7%）、愛(ài)德萬(wàn)甜（純度99.7%）固體標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自于上海安譜有限公司；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨，均為HPLC 級(jí)，購(gòu)自于上海安譜有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-三重四極桿線性復(fù)合離子阱 質(zhì) 譜 儀AB 5500QTRAP， 美 國(guó)SCIEX 公 司；phenomenex kinetex F5（100 mm×3.0 mm，2.6 μm）、phenomenex kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），美國(guó)菲羅門(mén)公司；電熱恒溫水浴鍋XMTD-400，上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司；電子天平AL204，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Millipore 超純水機(jī)，美國(guó)Millipore 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取50.0 mg固體標(biāo)準(zhǔn)品，分別用50%甲醇-水溶解定容至50 mL，得到濃度為1.0 mg/mL 單標(biāo)儲(chǔ)備母液。取每種單標(biāo)儲(chǔ)備母液0.5 mL，用50%甲醇-水稀釋定容至50 mL，得到濃度為10.0 μg/mL 混標(biāo)中間液，于≤5 ℃避光保存。系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.025 ～1.000 μg/mL）使用50%甲醇-水連續(xù)稀釋得到，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取白酒樣品5.0 g 置于燒杯中，于80 ℃水浴加熱20 min，殘?jiān)哭D(zhuǎn)至50 mL 容量瓶中，用水定容并搖勻，經(jīng)0.22 μm 水相微孔濾膜過(guò)濾于樣品瓶中，上機(jī)測(cè)試。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：phenomenex kjnetex F5，柱溫45 ℃，流動(dòng)相：A 流動(dòng)相為0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸銨水溶液，B 流動(dòng)相為乙腈，流速為0.4 mL/min，二元高壓模式。進(jìn)樣量5 μL，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：TurboV 電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI）負(fù)離子掃描；霧化氣（Gas1/Gas2）：50/50 Psi；離子化溫度：500 ℃；離子噴霧電壓（Ion Spray，IS）：-4 500 V；氣簾氣（Curtain Gas，CUR）：35 Psi；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)-信息關(guān)聯(lián)采集-增強(qiáng)子離子（多反應(yīng)監(jiān)測(cè)-信息關(guān)聯(lián)采集-增強(qiáng)子離子（Multi Reaction Monitoring-Information Dependent Acquisition-Enhancer Ion，MRM-IDA-EPI）。 化 合物攝入電壓：-10 eV；碰撞室射出電壓：-16 eV；碰撞模式：HIGH；碰撞氣：氮?dú)狻DA：峰閾值為1 600 cps。EPI：碰撞能量（Collision Energy，CE）為-35 eV，碰撞能量擴(kuò)展（Collision Energy Spread，CES）為15 eV。使用SCIEX OS 1.7 軟件對(duì)儀器進(jìn)行控制采集以及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

用1.0 μg/mL 混標(biāo)溶液進(jìn)樣，依據(jù)各化合物的分子質(zhì)量，使用Q1 掃描模式確定ESI 負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰即確定母離子質(zhì)荷比；選擇所確定的母離子，用二級(jí)子離子模式掃描，確定離子碎片信息，選定2 對(duì)響應(yīng)最強(qiáng)的特征離子作為定性離子，以響應(yīng)值最大碎片離子為定量離子，用MRM 模式，得到最優(yōu)的CE 和DP 值，初步建立質(zhì)譜分析方法，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2。

經(jīng)過(guò)優(yōu)化得到9 種化合物的質(zhì)譜參數(shù)，包括保留時(shí)間、定性定量離子對(duì)、去簇電壓（Declustering Potential，DP）及碰撞能量（Collision Energy，CE），如表2 所示。

表2 9 種甜味劑的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

2.2 色譜條件優(yōu)化

由于需采用MRM-IDA-EPI 模式進(jìn)行采集，質(zhì)譜掃描駐留時(shí)間僅8 ms，所以超高效液相色譜需要得到良好的色譜峰形，以滿足分析要求。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了phenomenex kinetex F5、phenomenex kinetex C182款色譜柱，2 款色譜柱均能實(shí)現(xiàn)白酒中9 種甜味劑的分離，但在濃度為25 ng/mL 時(shí)，phenomenex kinetex F5 色譜柱得到的S/N值更高，故選用此款色譜柱，如表3 所示。

表3 25 ng/mL 混標(biāo)不同色譜柱S/N 值比較結(jié)果

2.3 EPI 普庫(kù)的建立

通常超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜的MRM模式是通過(guò)定性離子對(duì)的保留時(shí)間、質(zhì)荷比、相對(duì)豐度比進(jìn)行定性。UPLC-QTARP 的MRM-IDA-EPI掃描方式，不僅可以使用MRM 定性模式，還增加了二級(jí)譜庫(kù)的匹配用于定性分析，由于離子阱的富集功能，在低濃度時(shí)可以有效提高離子響應(yīng)值，從而降低結(jié)果的假陽(yáng)性率。該方法在MRM 分析的基礎(chǔ)上，以預(yù)定義的信息關(guān)聯(lián)采集標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)觸發(fā)增強(qiáng)子離子二級(jí)質(zhì)譜掃描，其離子阱富集功能可獲得高靈敏度的二級(jí)質(zhì)譜信息。利用混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，通過(guò)MRM-IDA-EPI 模式采集在-20 eV、-35 eV、-50 eV 3 中碰撞能量下的質(zhì)譜圖，建立可搜索EPI 二級(jí)譜庫(kù)。將樣品分析時(shí)獲得的EPI 二級(jí)譜圖與譜庫(kù)進(jìn)行匹配搜索，通過(guò)正向和反向匹配的得分值判斷是否為目標(biāo)物，得分越高則定性結(jié)果的準(zhǔn)確度越高。如在實(shí)際檢測(cè)中，對(duì)含1 ng/mL 甜蜜素的白酒樣品，用EPIP 譜圖庫(kù)搜索匹配分仍有80 分。該方法通過(guò)一次進(jìn)樣同時(shí)滿足了高靈敏度的定量分析和基于譜庫(kù)的定性檢測(cè)需求。9 種化合物質(zhì)量色譜圖譜圖見(jiàn)圖1，1 ng/mL 甜蜜素樣品提取離子譜圖見(jiàn)圖2，1 ng/mL甜蜜素樣品EPI 譜圖搜索結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 1 ng/mL 甜蜜素EPI 譜圖搜索結(jié)果

圖1 9 種甜味劑質(zhì)量色譜圖

圖2 1 ng/mL 甜蜜素提取離子譜圖

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限

使用50%甲醇-水配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作液25 ～1 000 ng/mL，過(guò)0.22 μm 水相微孔濾膜過(guò)濾上機(jī)，以定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。9 種甜味劑線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R均大于0.995。按照信噪比（S/N）=3和S/N=10 計(jì)算方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），檢出限（LOD）分別在0.001 ～0.048 mg/kg，定量限（LOQ）為0.004 ～0.160 mg/kg。具體詳見(jiàn)表5。

表5 9 種甜味劑線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

2.4.2 回收率和精密度

選取未檢出甜味劑的白酒作為本底，進(jìn)行3 種濃度水平0.25 mg/kg、0.50 mg/kg、1.00 mg/kg 的添加實(shí)驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定6 次。結(jié)果如表6 所示，樣品平均加標(biāo)回收率為80.9%～110.1%，RSD 為3.78%～11.80%，均滿足樣品痕量檢測(cè)要求。

表6 白酒中9 種甜味添加回收率和精密度（n=6）

2.5 市售白酒樣品的測(cè)定

按照上述優(yōu)化、建立的白酒9 種甜味劑測(cè)試方法，于市場(chǎng)上隨機(jī)選取了醬香型白酒、清香型白酒、濃香型白酒、濃香型、鳳香型、清香型、稻谷香型、兼香型及小作坊自釀純糧酒等40 個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，其中甜蜜素檢出3 份，濃度分別為0.025 mg/kg、0.013 mg/kg、0.260 mg/kg，三氯蔗糖檢出1 份，濃度為0.96 mg/kg，其余均為未檢出。

（續(xù)表6）

3 結(jié)論

本研究建立了UPLC-QTARP 方法同時(shí)檢測(cè)白酒9 種甜味劑的方法，本方法前處理簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、在低濃度時(shí)判定陽(yáng)性可靠度高，適用于白酒中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、紐甜、阿力甜、三氯蔗糖、愛(ài)得萬(wàn)甜及麥芽糖醇的檢測(cè)。