周宇晨，耿思緣，宋春璐，夏元鳳，潘玉愛

（大連產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測研究院有限公司，遼寧大連 116000）

隨著食品行業(yè)的快速發(fā)展，由微生物引起的食品安全事件頻發(fā)，個別食品廠商為了盲目追求經(jīng)濟效益而忽略了食品微生物檢測質(zhì)量。因此在現(xiàn)階段加強食品微生物檢測質(zhì)量變得十分重要，PCR 技術(shù)具有十分重要的技術(shù)應(yīng)用價值，在全國各地具有比較廣泛的應(yīng)用[1]。

1 常見PCR 技術(shù)類型分析

PCR 技術(shù)的又叫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，初見于20 世紀(jì)80 年代中期，也被稱之為基因體外擴增檢測技術(shù)。應(yīng)用過程中，針對靶NDA 雙鏈進行加熱變形，將其轉(zhuǎn)化為單鏈結(jié)構(gòu)，靶DNA 兩端正鄰近序列互補的寡核苷酸片段分為左端引物、右端引物，與互補DNA 單鏈堿基形成互補結(jié)合反應(yīng)。在4 種dNTPs 底物以及DNA 聚合酶共存的情況下，這些引物會在模板DNA 鏈中逆時針進行延伸，并形成新DNA 雙鏈，在循環(huán)反復(fù)幾十次的反應(yīng)后，可使靶DNA 序列擴增數(shù)百萬倍，在食品微生物檢測領(lǐng)域中體現(xiàn)出了較高的應(yīng)用價值。就目前來看，現(xiàn)階段的PCR 檢測方法在以下幾種技術(shù)中有較多的應(yīng)用。

1.1 多重PCR 技術(shù)

和以往所用的傳統(tǒng)PCR 技術(shù)比較類似，然而多重PCR 技術(shù)在相同的反應(yīng)體系中，與傳統(tǒng)PCR 技術(shù)相比多了一對或多對特異性引物，這些引物特異性互補模板共存條件下，可以從相同反應(yīng)罐中擴增出相應(yīng)數(shù)量的DNA 片段。多重PCR 技術(shù)實質(zhì)上屬于在傳統(tǒng)PCR 技術(shù)的完善與發(fā)展下所形成的新型PCR擴增技術(shù)，可以在食物微生物檢測過程中，將多種種類、數(shù)量的微生物得以有效檢測出來，具有比較廣泛的應(yīng)用[2]。

1.2 實時定量PCR 技術(shù)

實時定量PCR 技術(shù)屬于一種新型PCR 技術(shù)，不僅可以有效體現(xiàn)出PCR 技術(shù)的靈敏度與便捷性，還可以解決常規(guī)PCR 技術(shù)在應(yīng)用過程中可能出現(xiàn)的假陽性污染問題，顯著提高定量檢測準(zhǔn)確性效果，同時具有良好的重復(fù)性與低廉的費用成本。與傳統(tǒng)PCR 技術(shù)的基本原理不同，定時定量PCR 技術(shù)在應(yīng)用過程中，以熒光染料、探針來促進擴增特異性發(fā)展，熒光信號強弱與擴增產(chǎn)物量形成正比例關(guān)系，對保障定量檢測的準(zhǔn)確性具有重要意義。

1.3 PCR-ELISA 技術(shù)

該技術(shù)將PCR 技術(shù)與免疫酶技術(shù)進行結(jié)合，在食品致病性微生物的快速檢測過程中體現(xiàn)出了較強的技術(shù)性。PCR-ELISA 技術(shù)所得檢測結(jié)果與凝膠電泳方法所測結(jié)果相比，靈敏度更高，屬于一種新型病毒DNA 檢測技術(shù)。通過液相雜交法，使標(biāo)記有生物素的PCR 擴增產(chǎn)物與特異探針呈液相混合，將探針與微孔板進行結(jié)合，酶標(biāo)記抗體與雜交分子產(chǎn)生反應(yīng)，在顯色反應(yīng)之后可以借助酶標(biāo)儀準(zhǔn)確讀數(shù)以評估檢測結(jié)果，具有較高的檢測準(zhǔn)確率。

2 在常見食品微生物檢測過程中的PCR 應(yīng)用探討

2.1 沙門氏菌

對于許多食品而言，沙門氏菌數(shù)量相對比較少，主要原因在于食品在生產(chǎn)與加工過程中，會受到各種各樣的原因，對食品中原有沙門氏菌產(chǎn)生一定的損傷作用，導(dǎo)致沙門氏菌含量顯著下降，而這種現(xiàn)象很有可能導(dǎo)致食品微生物檢測缺乏一定的準(zhǔn)確性價值。多重PCR 技術(shù)可以有效鑒別出沙門氏菌的血清型信息，同時還可以檢測出其中的突變狀況，一般在比較常用的特異引物基因中包含invA、invB、invC、invE、fimA、hns 以及spvd 等。在相關(guān)研究中，有學(xué)者利用沙門氏菌的特異性基因hns、invA、invB 作為引物，多重PCR 技術(shù)檢測應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)，二重PCR 與單一PCR 檢測之間具有一定的相似性，而三重PCR 技術(shù)可以顯著提高檢測靈敏度，與常規(guī)檢測方法相比之下，PCR 技術(shù)的檢測檢出率相對十分高[3]。

2.2 腸出血性大腸桿菌

在大腸桿菌中所產(chǎn)生的毒素普遍具有相似性，以往的單一PCR 技術(shù)難以有效鑒定出大腸桿菌以及出血性大腸桿菌之間的差異。通過多重PCR 技術(shù)的應(yīng)用，在stx2、溶血素基因、賀霉素基因、緊密素基因以及脂多糖基因等目的基因中，開展食品微生物檢測工作。有研究顯示，在免疫磁分離技術(shù)以及多重PCR 技術(shù)的共同檢測過程中，可以有效檢測出牛肉中所存在的大腸桿菌，通過stx1、stx2、eae 及hly 等基因的分析，有效鑒別出大腸桿菌的主要類型[4]。在相同檢測方法應(yīng)用中，對牛肉中的大腸桿菌O157:H7流行因子，體現(xiàn)出了較高的檢測效果，與以往的血清法檢測結(jié)果相比，多重PCR 檢測技術(shù)具有極高的檢測準(zhǔn)確性與靈敏度、實用性。

2.3 金黃色葡萄球菌

這類微生物在蔬菜、生肉中十分常見，具有較高的繁殖量，在繁殖結(jié)束后會形成腸毒素SE，并且很有可能出現(xiàn)食物中毒現(xiàn)象。而在腸毒素SE 檢測過程中，通常需要針對sea、seb、sed、seh 及sei 等基因進行檢測。在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，將腸毒素基因、金黃色葡萄球菌中的23S rRNA、編碼耐熱核酸酶基因進行結(jié)合而形成的PCR 檢測方法，可以有效檢測出牛奶、生肉中所存在的金黃色葡萄球菌。免疫檢測法在檢測應(yīng)用過程中很難檢測出腸毒素基因，需要應(yīng)用更高靈敏度的檢測技術(shù)，PCR 技術(shù)可以有效滿足金黃色葡萄球菌的檢測需求。

2.4 產(chǎn)單核李斯特菌

個別國家、地區(qū)中所出現(xiàn)的食品中毒事件中發(fā)現(xiàn)了主要致病菌是產(chǎn)單核李斯特菌，市場部門與食品檢測部門對此十分關(guān)注，該致病菌很有可能使人類、動物產(chǎn)生相同的疾病，尤其在未經(jīng)烹煮的食品、肉類中尤為常見，而易受該致病菌感染的人群主要為幼齡兒童、老年人以及存在免疫功能缺陷等人群。這種致病菌具有較強的耐低溫性特點，可以在普通冰箱中正常繁殖，在部分防腐劑的應(yīng)用中還可以體現(xiàn)出一定的抗性特點，因此很難有效清除食品中所存在的產(chǎn)單核李斯特菌。以往的致病菌檢測需要先從樣品中培養(yǎng)細(xì)菌，而PCR 技術(shù)可以直接在樣品中進行，在李斯特菌感染的肉類產(chǎn)品中，應(yīng)用半套式PCR 技術(shù)，可以模擬陽性牛奶致病菌，在存活10 個以上活菌的情況下，可以擴增出對應(yīng)特異性產(chǎn)物，與傳統(tǒng)PCR 技術(shù)相比，體現(xiàn)出了更為優(yōu)異的檢測靈敏度。在實際檢測試驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，ERIC2PVR 技術(shù)可以通過擴增過程獲取1 600 bp 的DNA 片段，在兩種檢測方法應(yīng)用中所形成的檢測結(jié)果十分相似。在PCR 擴增過程中可以發(fā)現(xiàn)李斯特菌中的inl 靶基因?qū)儆谔赜谢蚱危欢F(xiàn)階段并沒有在該致病菌的其他類型中發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的基因片段，而通過對沙門氏菌、大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌的檢測結(jié)果對比中發(fā)現(xiàn)，實際檢測結(jié)果均為陰性，因此在PCR 檢測產(chǎn)單核李斯特菌中具有較高的檢測價值。

2.5 非致病菌

相關(guān)研究顯示，將rRNA ISR 與16S rRNA 共同構(gòu)建形成多重PCR 技術(shù)，通過對真空包裝中的牛肉進行檢測，分別應(yīng)用變形梯度凝膠電泳法與PCR 技術(shù)進行檢測，在實際檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，兩種檢測方法所得出來的結(jié)論基本相似，體現(xiàn)出了在發(fā)酵時間越長的情況下，非致病菌檢出率越高[5]。在檢測過程中，多重PCR 技術(shù)具有良好的重復(fù)性優(yōu)勢，有效解決了以往在16S rRNA 無法重復(fù)檢測出泡菜中所存在的乳酸菌難題，體現(xiàn)出了優(yōu)良的檢測價值。

3 PVR 技術(shù)在食品微生物檢測中的流程分析

3.1 引物設(shè)計

一般來說，擴增特異性的情況下，PCR 引物往往具有關(guān)鍵作用，PCR 引物質(zhì)量與之具有密切的關(guān)系。引物一般待在分析基因組中的高度保守區(qū)域中，且長度一般是18 ～30 個堿基。對于多重PCR 引物而言，退火溫度要盡量保持一致，可以有效滿足引物在所選擇的退火溫度下具有相同的擴增效率，因此還要確保這些引物之間不存在各類相互作用影響。此外在引物設(shè)計過程中，還要結(jié)合分子生物學(xué)軟件開展分析工作，要注意利用電泳以及其他方法，將所擴增的產(chǎn)物大小有效區(qū)分開。

3.2 制備模板

應(yīng)用PCR 檢測技術(shù)，為了能夠保障PCR 檢測可靠性，不僅依賴于檢測方法的精準(zhǔn)性，更依賴目標(biāo)模板純度以及目標(biāo)分?jǐn)?shù)數(shù)量大小，而在大多數(shù)情況下，PCR 檢測技術(shù)要求富集步驟。在相關(guān)研究表明，在檢測前階段將食品原樣中的細(xì)菌得以有效分離出來，并在濃縮、純化過程中有效改善檢測結(jié)果[6]。就現(xiàn)階段而言，各類分離純化方法在食品體系中的細(xì)菌濃縮過程中具有較為廣泛的應(yīng)用，其中陰陽離子交換數(shù)值、免疫磁性分離法、固定化凝集素等最具有代表性。

3.3 擴增基因

擴增DNA 片段序列的不同供選擇適宜的PCR參數(shù)，在退火時間、溫度、引物中進行PCR 擴增作用，也可以應(yīng)用定量PCR 技術(shù)、多重PCR 技術(shù)以及巢式PCR 等衍生技術(shù)進行基因擴增，以保障PCR 技術(shù)檢測應(yīng)用效果得到進一步提升。

3.4 PCR 產(chǎn)物分析

在擴增基因之后將所擴增得到的產(chǎn)物，以凝膠電泳、染色處理時，借助紫外線照射可以清晰地看到擴增特意區(qū)段中的DNA 帶，在不同DNA 帶下可以有效鑒定出相應(yīng)的DNA。為了能夠有效提高對擴增產(chǎn)物的檢測質(zhì)量，也可以借助序列測定等方法，在序列分析中提高檢測結(jié)果準(zhǔn)確率[7]。

4 結(jié)語

在生物技術(shù)與自動化技術(shù)的快速發(fā)展過程中，PCR 技術(shù)的應(yīng)用使我國食品安全檢測領(lǐng)域有了顯著的發(fā)展成果，應(yīng)用PCR 技術(shù)不僅有利于提高微生物檢測水平，還可以推動跨國貿(mào)易質(zhì)量得到進一步發(fā)展，具有極其關(guān)鍵的意義與價值。