常紅，袁騰騰，呂淑婕，王雷，2，陳衛(wèi)東，2，張彩云*，桑冉（.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 23002；2.安徽省中藥方劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 23002；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠 233099；4.蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233030）

骨質(zhì)疏松癥會(huì)導(dǎo)致骨脆性增加并容易發(fā)生骨折[1]。目前對于骨質(zhì)疏松癥的治療主要包括服用抗骨吸收藥物，如雌激素、雙膦酸鹽及降鈣素和使用促進(jìn)骨形成藥物，如甲狀旁腺激素。但長期服用會(huì)對機(jī)體產(chǎn)生損害，有研究表明，長期服用雌激素，乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、心臟病及中風(fēng)等疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加[2-3]。亦有長期服用雙磷酸鹽導(dǎo)致頜骨壞死等并發(fā)癥發(fā)生的相關(guān)報(bào)道[4-5]。有些中藥具有治療骨質(zhì)疏松癥的作用，因不良反應(yīng)少、療效顯著等特點(diǎn)，正逐漸被認(rèn)可作為治療骨質(zhì)疏松癥的一種重要的輔助和替代療法[6]。

骨疏靈是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑（專利號：ZL200310112848.5），由淫羊藿、牛膝、黃芪和牡蠣4 味中藥組成，臨床上主要用于治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，療效確切且無明顯不良反應(yīng)[7-10]。中藥成分復(fù)雜，指紋圖譜具有整體性和模糊性，常作為中藥質(zhì)量評價(jià)和控制的分析方法[11-13]?；诖?，本研究擬通過超高效液相色譜法（UPLC）建立骨疏靈的指紋圖譜，并對其進(jìn)行相似度評價(jià)和聚類分析，同時(shí)對指認(rèn)出的有效成分進(jìn)行含量測定，從定性和定量兩個(gè)方面對骨疏靈進(jìn)行評價(jià)，為其質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY H-class 超高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Hei-VAP 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國海道爾夫公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；JY502 型電子天平（上海浦春計(jì)量儀器有限公司）；AB135-S 型十萬分之一電子天平（德國梅特勒-托利多公司）；Milli Q-Plus 超純水系統(tǒng)（美國密理博公司）；WB-2000型數(shù)顯恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 試藥

色譜級乙腈（批號：SHBM1775，美國默克公司）；色譜級甲醇（批號：21110106G401，瑞典歐普森有限公司）；色譜級甲酸（批號：J2027129，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；超純水（美國密理博公司），其他化學(xué)試劑均為分析純。朝藿定A（批號：JOT-10354）、朝藿定B（批號：JOT-10353）（對照品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）；毛蕊異黃酮（批號：MUST-18120901）、毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷（批號：MUST-19031920）、朝藿定C（批號：MUST-19081310）、蛻皮激素（批號：MUST-18120209）、淫羊藿苷（批號：MUST-18091010）、芒柄花苷（批號：MUST-19041101）（對照品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，成都曼思特生物科技有限公司）。原料藥材的詳細(xì)信息如表1 所示。經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院俞年軍教授鑒定，均符合2020年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。各飲片按處方比例隨機(jī)組合，得到12 批骨疏靈樣品（編號S1 ～S12），見表2。

表1 骨疏靈中各單味藥飲片信息來源Tab 1 Source information of decoction piece of each ingredient of GSL

表2 12 批骨疏靈樣品的藥材組合Tab 2 Medicinal material combinations of 12 batches of GSL

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 分別精密稱定朝藿定A 2.93 mg、朝藿定B 3.47 mg、朝藿定C 3.26 mg、淫羊藿苷4.62 mg、芒柄花苷2.97 mg、毛蕊異黃酮2.01 mg、毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷2.07 mg、蛻皮激素1.07 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，配制成單一對照品儲備液。量取各單一對照品儲備液適量，加甲醇配制成朝藿定A 29.3 μg·mL－1、朝藿定B 34.7 μg·mL－1、朝藿定C 32.6 μg·mL－1、淫羊藿苷46.2 μg·mL－1、芒柄花苷29.7 μg·mL－1、毛蕊異黃酮20.1 μg·mL－1、毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷20.7 μg·mL－1、蛻皮激素10.7 μg·mL－1的混合對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備[14]取淫羊藿飲片15 g，黃芪飲片20 g，牛膝飲片12 g，牡蠣飲片8 g。淫羊藿與牛膝中加入8 倍量的（第1 次多加3 倍量）70%乙醇，回流提取3 次，每次2 h；黃芪與牡蠣中加入8 倍量的（第1 次多加1.5 倍量）水，煎煮2次，每次1 h。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將乙醇提取液回收乙醇后與水提液合并，濃縮至生藥質(zhì)量濃度為1.0 g·mL－1。取適量骨疏靈樣品溶液用甲醇稀釋，使生藥質(zhì)量濃度為0.1 g·mL－1，取上清液，0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，備用。單味藥制備方法相同。

2.2 色譜條件

采用ACQUITY H-class 超高效液相色譜儀系統(tǒng)，色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫35℃；流速0.15 mL·min－1；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），洗脫梯度（見表3）；檢測波長為260 nm。

表3 洗脫梯度程序Tab 3 Elution gradient

2.3 骨疏靈指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗(yàn) 按照“2.1.2”項(xiàng)下操作制備骨疏靈供試品溶液（編號S5），連續(xù)進(jìn)樣6 次。以淫羊藿苷為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果其對應(yīng)RSD分別小于0.31%和2.7%，表明該方法的精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號S5 的骨疏靈供試品溶液分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h，進(jìn)樣測定。以淫羊藿苷為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果其對應(yīng)RSD分別小于0.27%和2.3%，表明供試品溶液在室溫條件下放置24 h 穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一編號骨疏靈樣品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，進(jìn)樣測定。以淫羊藿苷為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果其對應(yīng)RSD分別小于0.35%和2.8%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.4 指紋圖譜的建立 制備12 批骨疏靈供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 版）》對色譜圖進(jìn)行分析，以S5 為參照圖譜，時(shí)間窗的寬度設(shè)置為0.1 min，采用多點(diǎn)校正及全譜峰匹配生成UPLC 疊加指紋圖譜（見圖1），采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜（見圖2）。結(jié)果12 批骨疏靈供試品的指紋圖譜中共標(biāo)定了43 個(gè)共有峰。

圖1 12 批骨疏靈樣品疊加的UPLC 指紋圖譜Fig 1 UPLC fingerprint of 12 batches of Gushuling samples superimposed

圖2 骨疏靈的UPLC 對照指紋圖譜Fig 2 UPLC control fingerprint of Gushuling

2.3.5 共有峰的指認(rèn) 通過與混合對照品的色譜圖比對，指認(rèn)出8 個(gè)共有峰，即峰13 是毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷、峰16 是蛻皮激素、峰28是芒柄花苷、峰30 是毛蕊異黃酮、峰37 是朝藿定A、峰38 是朝藿定B、峰41 是朝藿定C、峰42 是淫羊藿苷。指認(rèn)出的8 個(gè)共有峰占總共有峰峰面積比例為68.2%（見圖3）。

圖3 混合對照品和骨疏靈樣品的UPLC 圖Fig 3 UPLC of mixed reference（HB）and Gushuling sample

2.3.6 相似度評價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 版）》對12 批骨疏靈樣品進(jìn)行相似度評價(jià)。結(jié)果12 批骨疏靈樣品圖譜與對照指紋圖譜的相似度為0.9920 ～0.9960，表明不同批次樣品間相似度較高，見表4。

表4 12 批骨疏靈樣品的相似度評價(jià)結(jié)果Tab 4 Similarity evaluation of 12 batches of Gushuling samples

2.4 聚類分析

以12 批骨疏靈樣品中8 種成分的峰面積為變量，使用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用離差平方和法以平方歐式距離為區(qū)間進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4。當(dāng)平方歐氏距離為2 時(shí)，12 批樣品可聚為三類，S4 聚為一類，S7 聚為一類，其余10 批聚為一類；當(dāng)平方歐氏距離為3 時(shí)，12 批樣品可聚為兩類，S4 聚為一類，其余11 批聚為一類。

圖4 12 批骨疏靈樣品的聚類分析Fig 4 Cluster analysis of 12 batches of Gushuling samples

2.5 8 種有效成分的含量測定

2.5.1 專屬性考察 取空白甲醇、混合對照品溶液和各樣品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷、蛻皮激素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷色譜峰的分離度均良好，且陰性樣品無干擾，見圖5。

圖5 骨疏靈樣品中8 種成分專屬性試驗(yàn)色譜圖Fig 5 Chromatogram of 8 components in Gushuling samples for specific tests

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密吸取單一對照品儲備液用甲醇稀釋，制成系列對照品溶液，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以各化合物的質(zhì)量濃度（X，μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表5。

表5 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 5 Linearity

2.5.3 精密度試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液（編號S5），連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果8種成分峰面積的RSD在0.12%～2.7%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號S5 的骨疏靈供試品溶液分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果8 種成分峰面積的RSD在0.25%～2.3%（n＝7），表明供試品溶液在室溫條件下放置24 h 穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批骨疏靈樣品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果8 種成分峰面積的RSD在0.15%～2.8%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的骨疏靈供試品（編號S5），分別精密加入與樣品中各成分等量的單一對照品溶液（以甲醇為溶劑），進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷、蛻皮激素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的加樣回收率分別為101.14%、96.04%、104.10%、96.73%、98.98%、98.06%、96.19%、96.93%，RSD分別為1.3%、4.0%、3.1%、1.8%、0.24%、0.88%、0.13%、0.22%。

2.5.7 樣品含量測定 取12 批骨疏靈供試品溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算各成分含量，結(jié)果見表6。由表6 可知，朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷等成分含量較高，不同批次間的各個(gè)成分含量存在一定的差異，主要是由于原藥材質(zhì)量的影響。

表6 12 批骨疏靈供試品中8 種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg·g－1)Tab 6 Content of 8 components in 12 batches of Gushuling (mg·g－1)

3 討論

通過PDA 全波長掃描發(fā)現(xiàn)，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的最大吸收波長在270 nm，蛻皮激素的最大吸收波長在250 nm，毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷的最大吸收波長在260 nm，綜合考慮整體化合物的最大吸收，最終選擇260 nm 作為檢測波長。

淫羊藿苷是淫羊藿的主要有效成分，其色譜峰的響應(yīng)值相對較高，出峰時(shí)間適中，因此選擇其為參照峰。本研究建立了12 批骨疏靈的UPLC 指紋圖譜，與對照指紋圖譜的相似度為0.9920～0.9960，說明12 批骨疏靈樣品的質(zhì)量穩(wěn)定。

通過與對照品的色譜圖進(jìn)行比對，指認(rèn)了12批骨疏靈中的8 個(gè)共有峰，包括來自于君藥淫羊藿中的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 和淫羊藿苷，臣藥牛膝的蛻皮激素，使藥的主要有效成分毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮，均為《中國藥典》中單味藥所規(guī)定的指標(biāo)性成分。朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 和淫羊藿苷能刺激成骨細(xì)胞的分化，其中淫羊藿苷的效果最顯著[15]。蛻皮激素可通過抑制骨丟失和細(xì)胞凋亡以及誘導(dǎo)自噬，預(yù)防潑尼松誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松癥[16]。毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮可通過增加內(nèi)源性抗氧化劑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用[17]。因此，本研究選擇這些成分作為考察骨疏靈質(zhì)量的控制指標(biāo)。

綜上所述，本研究建立了骨疏靈的UPLC 指紋圖譜和8 種主要成分的含量測定方法，可用于控制該方的質(zhì)量。