許璐，曹宇，朱瀚朝，王四旺，湯海峰*（.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系中藥與天然藥物學(xué)教研室，西安 7003；.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管外科，西安 7003）

膿毒癥是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，其本質(zhì)是宿主對(duì)感染的反應(yīng)。這種反應(yīng)一旦失調(diào)，將引起宿主器官功能障礙，嚴(yán)重者危及生命，全球每年已有數(shù)百萬(wàn)人死于膿毒癥[1-3]。心肌功能障礙是臨床膿毒癥的主要并發(fā)癥之一，與病死率的增加密切相關(guān)，伴有心肌功能障礙的患者病死率達(dá)70%～90%，遠(yuǎn)高于沒有心肌功能障礙的患者[4]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激、炎癥損傷在膿毒癥引起的心肌功能障礙的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[5-6]。

牛至油（origanum oil，ORG）是從植物牛至（Origanum vulgareL.）中提取的一種具有特殊芳香氣味的揮發(fā)油，約占全株重量的0.5%～7%；香芹酚（carvacrol，CAR）和麝香草酚（thymol，THY）是牛至油中生物活性較強(qiáng)的兩種成分[7-8]。牛至油及其所含香芹酚和麝香草酚可作為食品添加劑和化學(xué)香料，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗真菌、抗癌、保肝、擴(kuò)張血管等多種藥理活性[9-11]。目前，對(duì)牛至油及其所含香芹酚和麝香草酚的研究大多為體外研究，其潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠膿毒癥致心肌損傷模型，通過(guò)觀察小鼠心臟功能、心肌組織的病理變化以及炎癥細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激等的變化，探討牛至油及其所含香芹酚和麝香草酚對(duì)LPS 誘導(dǎo)小鼠心肌損傷的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 ～10 周雄性C57BL/6 小鼠， 體質(zhì)量20 ～25 g [空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（軍）字第2019-001 號(hào)]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案由空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)（中國(guó)西安）審查，批準(zhǔn)文號(hào)：SYXK（陜）2019-001，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物使用指南進(jìn)行。

1.2 試藥

牛至油（批號(hào)：20180404，江西省吉水縣俊達(dá)天然香料油廠）；香芹酚（批號(hào)：20170603，吉水縣益康天然香料油提煉廠）；麝香草酚（批號(hào)：20170415，上海邁坤化工有限公司）；亞胺培南（imipenem，IPM，Merck Sharp & Dohme Corp）；脂多糖（LPS，北京索萊寶科技有限公司）；異氟烷（山東科源制藥股份有限公司）；肌酸激酶同工酶（CK-MB）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；乳酸脫氫酶（LDH）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）；蘇木素-伊紅（HE）染液（武漢谷歌生物科技有限公司）。

1.3 儀器

小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)（加拿大Visual Sonics 公司）；熒光顯微鏡、FV 10i 激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus 公司）；電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；移液槍一套（德國(guó)Eppendorf 公司）；全自動(dòng)研磨儀（賽維爾生物）；低速離心機(jī)（湖南賽特湘儀有限公司）；超純水系統(tǒng)（青島富勒姆科技）；－80℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-TeK 公司）；電子恒溫水浴鍋（姜堰市天力醫(yī)療器械廠有限公司）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，稱質(zhì)量，隨機(jī)分為6 組，每組12 只，分組及給藥情況如下：正常對(duì)照組（CON），正常飲食飲水；牛至油（LPS＋ORG，50 mg·kg－1）、香芹酚[9，12]（LPS ＋CAR，40 mg·kg－1，與50 mg·kg－1牛至油中所含香芹酚等量）及麝香草酚（LPS ＋THY，5 mg·kg－1，與50 mg·kg－1牛至油中所含麝香草酚等量）、亞胺培南（陽(yáng)性藥，LPS ＋I(xiàn)PM，120 mg·kg－1）組分別灌胃給藥，模型組灌胃與給藥組等量的生理鹽水，每日一次，連續(xù)7 d。除正常對(duì)照組動(dòng)物外，其余各組小鼠末次給予試藥（第7日）后1 h 腹腔注射10 mg·kg－1LPS 誘導(dǎo)膿毒癥心肌損傷模型。

2.2 小鼠一般情況觀察

觀察各組小鼠在給藥及造模前后飲食飲水，反應(yīng)及活動(dòng)情況。

2.3 超聲心動(dòng)圖測(cè)量

造模12 h 后，各組隨機(jī)選取6 只小鼠放入麻醉箱中，異氟烷吸入麻醉，脫去胸腹部被毛，仰位固定于加熱板上（37℃），維持2%異氟烷流速以穩(wěn)定小鼠麻醉狀態(tài)，胸部涂抹超聲耦合劑，將超聲探頭緊貼小鼠心臟位置，調(diào)整探頭記錄M 型超聲心動(dòng)圖，獲得左室心臟活動(dòng)圖像（心動(dòng)圖）。使用Vevo LAB 3.1.0 軟件連續(xù)測(cè)量3 個(gè)心動(dòng)周期后取平均值，計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左室短軸縮短率（LVFS）。

2.4 心肌酶檢測(cè)

各組動(dòng)物檢測(cè)心功能后，經(jīng)頸動(dòng)脈采集血液留存，4 ℃過(guò)夜，4000 r·min－1離心15 min，吸取上層血清保存在－80℃冰箱。各組隨機(jī)選取8 只小鼠血清，按照說(shuō)明書步驟檢測(cè)血清中LDH和CK-MB 的水平。

2.5 心肌組織HE 染色

各組隨機(jī)選取4 只小鼠，心臟行多聚甲醛（PFA）灌注后剖取，固定在4% PFA 溶液中，石蠟包埋，切片；再經(jīng)蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。

2.6 小鼠血清中炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量

各組隨機(jī)選取8 只小鼠血清，按照說(shuō)明書步驟采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的含量。

2.7 小鼠心肌組織中SOD、MDA 水平檢測(cè)

心臟經(jīng)主動(dòng)脈灌注PBS 后，立即凍存于液氮中。選取8 只小鼠心臟組織，勻漿，離心后取上清液，按照說(shuō)明書步驟檢測(cè)組織中SOD 和MDA 的水平。

2.8 心臟組織活性氧（ROS）染色

選取8 只小鼠心臟組織，制作心肌冰凍切片，用DHE 染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。奧林巴斯FV1000 激光共聚焦顯微鏡對(duì)處理過(guò)的組織切片進(jìn)行檢測(cè)，平均熒光強(qiáng)度測(cè)定采用Image-Pro plus分析。

2.9 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0 軟件分析，數(shù)據(jù)以±s 表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況觀察

造模前各組小鼠活動(dòng)正常，飲食飲水正常。腹腔注射LPS 后，小鼠出現(xiàn)精神萎靡不振，毛發(fā)松亂，行動(dòng)遲緩，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，飲食飲水減少，出現(xiàn)寒顫狀況，眼角周圍有白色分泌物產(chǎn)生，糞便不成形，肛門處有糞便粘連。上述情況在亞胺培南、牛至油及香芹酚用藥組中明顯較輕；麝香草酚組改善不明顯。

3.2 超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)心功能

LPS 注射12 h 后，采集M 型超聲，結(jié)果如表1 和圖1 所示。與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠出現(xiàn)左心室功能障礙，LVEF 和LVFS 值明顯下降（P＜0.01），提示注射LPS 導(dǎo)致小鼠心臟收縮功能下降，心功能降低。與模型組相比，牛至油及香芹酚干預(yù)組的LVEF 和LVFS 明顯升高（P＜0.05，P＜0.001），麝香草酚組LVEF 和LVFS 值具有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。牛至油和香芹酚組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 超聲心動(dòng)圖Fig 1 Cardiac function by echocardiography

表1 各組小鼠心功能相關(guān)指標(biāo)比較 (x±s，n ＝6)Tab 1 Myocardial function indexes of mice in each group(x ±s，n ＝6)

3.3 各組小鼠血清中心肌酶及炎癥因子的比較

結(jié)果見表2，與正常對(duì)照組相比，LPS 誘導(dǎo)的心肌損傷小鼠血清中CK-MB、LDH、TNF-α、IL-6 和IL-1β水平明顯升高（P＜0.01）， 提示LPS 促使大量炎性因子入血。亞胺培南、牛至油及香芹酚干預(yù)組血清中CK-MB、LDH、TNF-α、IL-6 和IL-1β含量均明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），說(shuō)明亞胺培南、牛至油及香芹酚可抵抗LPS 促炎性因子釋放，從而改善心肌炎癥損傷。香芹酚組與牛至油組相比各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)顯著性差異。而麝香草酚組各項(xiàng)指標(biāo)與模型組相比無(wú)明顯差異。

表2 各組小鼠血清中心肌酶及炎癥因子的比較 (x ±s，n ＝8)Tab 2 Myocardial enzymes and inflammatory factors in each group (x ±s，n ＝8)

3.4 心臟組織病理學(xué)的變化

HE 染色光鏡下觀察，心肌及心肌細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)變化見圖2。與正常對(duì)照組相比，LPS 誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥心肌損傷，其心肌纖維排列不規(guī)則，一部分橫紋模糊甚至消失；可見血管出血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表明腹腔注射LPS 成功構(gòu)建膿毒癥心肌損傷模型。亞胺培南、牛至油和香芹酚干預(yù)小鼠的上述病變明顯獲得保護(hù)，可見心肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)及邊界明顯，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少。

圖2 小鼠心臟組織的病理學(xué)變化（×400，n ＝4）Fig 2 Histopathology of the heart tissues in each group（×400，n＝4）

3.5 各組小鼠心肌氧化應(yīng)激水平的比較

如圖3 和表3 所示，相比于正常對(duì)照組，注射LPS 后，小鼠心肌組織中SOD 活性顯著降低，MDA 濃度顯著升高，ROS 活性顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，亞胺培南、牛至油和香芹酚預(yù)給藥組SOD 活性顯著升高，ROS 及MDA含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；而麝香草酚組與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 各組小鼠心臟組織SOD 和MDA 的水平(x±s，n ＝8)Tab 3 SOD and MDA levels in heart tissues of mice in each group(x±s，n ＝8)

圖3 各組小鼠心臟組織ROS 的表達(dá)（×400，n ＝4）Fig 3 Expression of ROS in heart tissues of mice in each group（×400，n ＝4）

4 討論與結(jié)論

本研究從小鼠的一般狀況、心功能、心肌損傷標(biāo)志物以及組織病理學(xué)等多方面進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，表明牛至油及其所含等劑量的香芹酚能夠減輕膿毒癥心肌損傷模型小鼠心功能障礙，顯著減緩 LPS 誘導(dǎo)小鼠的心肌損傷，而麝香草酚作用較為有限。膿毒癥期間的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心肌功能障礙的一個(gè)關(guān)鍵因素[15]。在膿毒癥期間，過(guò)多的ROS 可激活脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞和線粒體膜損傷，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡和壞死[16]，進(jìn)一步引起大量?jī)?nèi)毒素的釋放，觸發(fā)一系列促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6 等）釋放造成嚴(yán)重且持續(xù)的炎癥反應(yīng)[17-18]，誘導(dǎo)心肌損傷。在心肌組織中，SOD 對(duì)調(diào)控ROS 生成方面起主要作用，是體內(nèi)重要的抗氧化酶[19]；MDA 是細(xì)胞膜磷脂在氧化應(yīng)激損傷過(guò)程中形成的產(chǎn)物，可反映脂質(zhì)過(guò)氧化的嚴(yán)重程度[20]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠心肌組織MDA 含量增加，SOD 活性明顯降低；而牛至油和香芹酚預(yù)處理組小鼠心肌組織MDA 含量降低，SOD 活性升高，表明牛至油和香芹酚可顯著抵抗LPS 誘發(fā)心肌組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)。此外，牛至油及香芹酚明顯降低模型小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6 水平，表明牛至油及香芹酚抑制了LPS 誘導(dǎo)的炎癥因子產(chǎn)生與釋放，提示其對(duì)心肌保護(hù)作用可能與抗炎作用有關(guān)。綜上，香芹酚可能是牛至油中保護(hù)LPS 誘發(fā)的膿毒癥心肌損傷的有效成分，但其發(fā)揮作用的劑量效應(yīng)關(guān)系及確切分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。