馬二蘭，張 帆，呂春秋，涂 連，王偉良，林 瑩,

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004；2.南寧海關(guān)技術(shù)中心，廣西南寧 530021）

芋頭（Taro,Colocasia esculenta（L.） Schott.）俗名芋艿，天南星科魁芋屬多年生草本植物。芋頭分為魁芋、魁子兼用芋、多子芋和多頭芋等，荔浦芋屬于魁芋類。荔浦芋為廣西特產(chǎn)，芋頭蛋白屬于塊莖類蛋白，球蛋白占可溶性蛋白的80%左右，球蛋白相對分子量較低，與很多生物學(xué)活性相關(guān)。芋頭的血糖生成指數(shù)值（Glycemic Index,GI）僅為47.7 左右，低于山藥（54）和土豆（66.4），但其淀粉含量高，因此推測芋頭中可能存在糖苷酶影響的活性物質(zhì)，而球蛋白與很多生物活性相關(guān)，芋頭球蛋白對糖代謝影響及機(jī)理研究具有重要意義[1]。芋頭蛋白具有抗氧化[2?3]、免疫調(diào)節(jié)[4?6]、抗腫瘤[7?8]、抗真菌[9?11]和血糖調(diào)節(jié)[12]等活性，一般采用α-淀粉酶抑制活性初步研究其血糖調(diào)節(jié)活性。McEwan 等[13]純化得到兩種α-淀粉酶抑制劑，能抑制動物來源的α-淀粉酶而不能抑制真菌淀粉酶。Seltzer 等[14]純化得一種糖蛋白，相對分子量11.80 kDa，pI=4.40，具有α-淀粉酶抑制活性。Kumari等[12]純化出一種糖蛋白，相對分子量13.90 kDa，發(fā)現(xiàn)其能抑制α-淀粉酶，最適pH 為6.90，70 ℃時(shí)保持81.50%的活性，可以抑制人的唾液α-淀粉酶和α-馬鈴薯淀粉酶。

胰島素抵抗（Insulin Resistance，簡稱IR）是指機(jī)體內(nèi)細(xì)胞對內(nèi)源性或外源性胰島素敏感性降低，導(dǎo)致外周靶組織對葡萄糖吸收效率下降的一種病理狀態(tài)[15]。HepG2 源于人的肝胚胎瘤細(xì)胞，保留了肝細(xì)胞的特征與功能，是體外研究胰島素抵抗和糖代謝的理想模型[16]。糖原是葡萄糖的儲存形式，HK 和PK是糖酵解的限速酶，螺旋藻蛋白質(zhì)能極顯著提高胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞的己糖激酶（Hexokinase，HK）和丙酮酸激（Pyruvate Kinase，PK）活性，通過促進(jìn)糖酵解來調(diào)節(jié)糖代謝[17]，可以通過葡萄糖消耗量，肝糖原合成量、己糖激酶和丙酮酸激酶活性表征活性物質(zhì)對糖代謝功能影響的機(jī)制。

本課題前期采用0.10 mol/L 的磷酸緩沖液（含0.30 mol/L NaCl，pH=6.8）提取、硫酸銨分離和DEAE-52 離子交換層析法純化得到一種純度93.27%±0.62%的球蛋白，分子量為22.00 kDa，等電點(diǎn)5.6±0.2，具有α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性，表現(xiàn)出一定的血糖調(diào)節(jié)潛力[18]。本文在此基礎(chǔ)上對該球蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，并以葡萄糖消耗量、肝糖原含量、HK 和PK 活性為指標(biāo)，首次闡明其對IR-HepG2 細(xì)胞血糖調(diào)節(jié)的影響機(jī)理，有助于進(jìn)一步理解荔浦芋球蛋白調(diào)節(jié)血糖的潛在機(jī)制，為荔浦芋球蛋白的活性研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荔浦芋球蛋白 前期實(shí)驗(yàn)提取純化所得[18]；HepG2 細(xì)胞株、青霉素-鏈霉素溶液（雙抗100×）武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM 高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶 比利時(shí)BI 公司；胎牛血清（FBS） 浙江天杭生物科技股份有限公司；Cell Counting Kit 8 試劑盒 新賽美生物科技有限公司；鹽酸二甲雙胍 上海麥克林生化科技有限公司；非變性組織/細(xì)胞裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；胰島素、葡萄糖含量檢測試劑盒 翼飛雪生物科技有限公司；糖原測定試劑盒、PK 測定試劑盒、HK 測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

DSC200PC 差式掃描量熱儀 德國耐馳儀器公司；NicoletiS10 傅里葉變換紅外光譜儀 美國熱點(diǎn)公司；MOS-450 圓二色譜儀 法國CBIO-LOGIN 公司；L8900 高速氨基酸分析儀 日本HITACHI 公司；CLM-240B-8-CN 二氧化碳培養(yǎng)箱 新加坡Esco公司；Infinite M200pro 酶標(biāo)儀 奧地利TECEN 公司；CKX41SF 倒置顯微鏡 日本OLYMPUS 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 球蛋白的差式掃描量熱分析 采用差示掃描量熱法測定球蛋白的熱穩(wěn)定性[19]。稱取5.00 mg 球蛋白，裝在坩堝中測定TP和△H 變化。儀器設(shè)置條件為：氮?dú)鈿饬髁?0 L/min，掃描溫度范圍25～150 ℃，升溫速率10 ℃/min。

1.2.2 球蛋白二級結(jié)構(gòu)鑒定

1.2.2.1 圓二色譜測定 參照Sharma 等[20]的方法，配制0.25 mg/mL 的球蛋白溶液，吸取適量注入1 mm光徑比色皿中，采用圓二色譜儀在190～260 nm 范圍掃描。

1.2.2.2 紅外光譜測定 參照孫佳銳等[21]的方法，將球蛋白與溴化鉀混合研磨、壓片，在4000～500 cm?1范圍內(nèi)掃描。

1.2.3 球蛋白氨基酸組成的測定 參照陳文等[22]的方法，采用氨基酸自動分析儀測定，稱取50.00 mg 球蛋白，酸水解后處理后過0.45 μm 濾膜，上樣進(jìn)行氨基酸分析，并以純化前的粗蛋白進(jìn)行對照分析氨基酸含量變化。

1.2.4 球蛋白對IR-HepG2 細(xì)胞糖代謝的影響

1.2.4.1 HepG2 細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇后，收集細(xì)胞，加入新鮮的完全培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2、濕度適宜的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和密度，培養(yǎng)至匯合度90%后，用胰酶消化3～5 min，每2 d 按1:3 傳代一次。

1.2.4.2 胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105cell/mL，接種于96 孔板（200 μL/孔），培養(yǎng)至70%細(xì)胞匯合度，加入含濃度為10?5、10?6、10?7、10?8、10?9mol/L 的胰島素培養(yǎng)24 h 和10?7mol/L 胰島素作用12、24、36 h 和48 h，按照葡萄糖含量檢測試劑盒說明書測定葡萄糖消耗量△GC，△GC＝對照組細(xì)胞葡萄糖含量-樣品組細(xì)胞葡萄糖含量。倒置顯微鏡下觀察IR-HepG2 細(xì)胞形態(tài)特征和生長狀態(tài)。

采用CCK8 法校正因細(xì)胞數(shù)量造成測定的結(jié)果差異。細(xì)胞活力的測定：按照試劑盒說明采用Cell Counting Kit 8（CCK8）法測定，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）=樣品組細(xì)胞數(shù)/對照組細(xì)胞數(shù)×100。細(xì)胞數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.0131x+0.1895，R2=0.9970，其中，y 為細(xì)胞濃度，單位1×104cell/mL，x 為OD450nm。

1.2.4.3 荔浦芋球蛋白對IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響 細(xì)胞復(fù)蘇后于96 孔板培養(yǎng)24 h 后，對照組加培養(yǎng)基，模型組采用10?7mol/L 胰島素作用36 h 造模，每孔200 μL，模型組又分為二甲雙胍（30 μg/mL）組和荔浦芋球蛋白高（500 μg/mL）、中（300 μg/mL）、低（100 μg/mL）劑量組[23]，繼續(xù)分別加入200 μL 二甲雙胍和相應(yīng)濃度球蛋白，作用24 h后，測葡萄糖含量，計(jì)算△GC，葡萄糖消耗增加率（%）=（△GC樣品組?△GC模型組）/△GC模型組×100。

1.2.4.4 荔浦芋球蛋白對IR-HepG2 細(xì)胞肝糖原合成量和HK、PK 活性的影響 細(xì)胞復(fù)蘇后于6 孔板培養(yǎng)24 h 后，對照組加培養(yǎng)基，模型組采用10?7mol/L胰島素作用36 h 造模，每孔2 mL，按1.2.4.3 的方法加樣2.00 mL，作用24 h 后，胰酶消化，收集細(xì)胞，采用裂解液裂解細(xì)胞，12000 r/min 在4 ℃離心5 min收集上清置于冰浴中，采用BCA 試劑盒法測定蛋白質(zhì)濃度，按試劑盒說明書測肝糖原含量和HK、PK 活性，肝糖原合成增加率（%）=（樣品組肝糖原含量?模型組肝糖原含量）/模型組肝糖原含量×100，酶活性增加率（%）=（樣品組酶活性?模型組酶活性）/模型組酶活性×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式，每組做三個(gè)平行，采用SPSS 17.0、Excel 2010 和Origin 8.0 軟件分析處理數(shù)據(jù)，圓二色譜數(shù)據(jù)采用Peakfit 擬合軟件和CDNN 軟件分析，紅外數(shù)據(jù)處理采用OMNIC 和Peakfit 擬合軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 荔浦芋球蛋白的差式掃描量熱分析

蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性可以用熱變性溫度TP和誘導(dǎo)變性所需要的能量焓值ΔH 來表示。ΔH 可以反映出蛋白分子的疏水性和親水性以及聚集程度，與蛋白的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)，ΔH 越大，表明蛋白親水性和分子聚集度越高。在一定的升溫或降溫過程中，采用差示掃描量熱儀對荔浦芋球蛋白質(zhì)的熱效應(yīng)進(jìn)行測定，可以間接反應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其所處的狀態(tài)。從圖1 中可以看出，荔浦芋球蛋白的變性溫度為79.30±1.36 ℃，ΔH 為7.46±0.53 J/g，變性溫度高說明蛋白具有較強(qiáng)的溫度耐受性，親水性和分子聚集度高，變性焓較高，說明球蛋白中有序結(jié)構(gòu)所占比例較大。

圖1 荔浦芋球蛋白的差示掃描量熱曲線Fig.1 Thermal denaturation curve of Lipu taro globulin

2.2 荔浦芋球蛋白的二級結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 圓二色譜分析 荔浦芋球蛋白的圓二色譜如圖2 所示，在209 nm 附近有負(fù)的最大吸收峰，為β-折疊的特征負(fù)吸收峰，不存在α-螺旋的雙負(fù)槽峰，因此可以推測球蛋白含有大量的β-折疊以及少量無規(guī)卷曲，少量或不含α-螺旋。利用CDNN 軟件計(jì)算荔浦芋球蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量：α-螺旋為8.12%，β-折疊為42.61%，無規(guī)卷曲為29.05%，β-轉(zhuǎn)角為20.22%。

圖2 荔浦芋球蛋白的圓二色譜圖Fig.2 Circular dichroism of Lipu taro globulin

2.2.2 傅里葉紅外光譜分析 通過分析荔浦芋球蛋白的紅外光譜圖（圖3 示），在1402 cm?1處的吸收比1539 cm?1的強(qiáng)，它們分別是-HN-C=O 的順式和反式結(jié)構(gòu)的吸收峰，且順式構(gòu)型能量比反式構(gòu)型高，穩(wěn)定性差，因此，表明荔浦芋球蛋白天然結(jié)構(gòu)可能在旋蒸濃縮或硫酸銨分離過程中遭到了一定程度地破壞，1643 cm?1處的吸收峰表明球蛋白中含有C=O 伸縮振動。

圖3 荔浦芋球蛋白的紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectrum of Lipu taro globulin

由表1 可以得到荔浦芋球蛋白吸收峰的歸屬，一般蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要受酰胺I 區(qū)和酰胺III 區(qū)的影響，因此，采用Peakfit 擬合軟件對荔浦芋球蛋白紅外光譜的酰胺I 區(qū)和酰胺III 區(qū)進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)去卷曲和曲線擬合，進(jìn)行多次擬合使殘差最小，使重疊的圖譜可以完全分開而有利于分辨，各個(gè)波長與其結(jié)構(gòu)對照關(guān)系計(jì)算蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)比例。

表1 荔浦芋球蛋白的酰胺基團(tuán)特征振動[24]Table 1 Characteristic vibration of amide groups of Lipu taro globulin[24]

由表2 可知，荔浦芋球蛋白二級結(jié)構(gòu)包括：5.04%～13.27%的α-螺旋，39.42%～42.14%的β-折疊，18.25%～24.16%的β-轉(zhuǎn)角，26.34%～31.38%的無規(guī)卷曲。二級結(jié)構(gòu)與圓二色譜略有差異，但趨勢一致，含量由高到低依次是β-折疊、無規(guī)卷曲、β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋。

表2 荔浦芋球蛋白二級結(jié)構(gòu)組成Table 2 Secondary structure composition of Lipu taro globulin

2.2.3 荔浦芋球蛋白氨基酸組成分析 荔浦芋球蛋白和粗蛋白的氨基酸組成如表3 所示。荔浦芋球蛋白中含量最高的三種氨基酸均為天冬氨酸、谷氨酸和亮氨酸，純化后分別占總氨基酸的17.70%、11.35%、10.39%，其中天冬氨酸和谷氨酸屬于酸性氨基酸。

荔浦芋球蛋白必需氨基酸組成評價(jià)如表4，球蛋白的氨基酸評分為103.10%，必需氨基酸含量符合FAO/WHO 成人推薦標(biāo)準(zhǔn)。

表4 荔浦芋球蛋白必需氨基酸組成評價(jià)Table 4 Evaluation of essential amino acid composition of Lipu taro globlin

脯氨酸（Pro）和丙氨酸（Ala）等與抑制二肽基肽酶-IV（DPP-IV）活性有關(guān)，能抑制碳水化合物水解生成葡萄糖[25]。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性受Leu 和Pro 這兩種疏水氨基酸影響[26]?；钚噪闹械母彼峥赡芡ㄟ^影響肽的柔韌性增加其與α-淀粉酶和α-葡糖苷酶的結(jié)合力[27]，脯氨酸在碳末端區(qū)域的存在是有效肽抑制劑的一個(gè)共同特征，也有報(bào)道保護(hù)肽免受蛋白水解[28]，亮氨酸被認(rèn)為是通過代謝變構(gòu)激活和/或膜去極化來增強(qiáng)胰島素分泌的關(guān)鍵，碳末端精氨酸對多肽的抑制活性有積極作用[29]。

2.2.4 荔浦芋球蛋白對IR-HepG2 細(xì)胞糖代謝的影響

2.2.4.1 胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立 由表5 可知，在胰島素濃度為1×10?7mol/L 時(shí)，細(xì)胞葡萄糖消耗最低，表明此時(shí)細(xì)胞處于胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，顯著減少了葡萄糖的吸收。

表5 不同胰島素濃度作用24 h 后細(xì)胞的葡萄糖消耗量Table 5 Glucose consumption of cells exposed to different insulin concentrations for 24 h

由表6 可知，與對照組相比，36 h 之前葡萄糖消耗量有顯著差異，在36 h 處差異達(dá)到最大，而48 h時(shí)雖然葡萄糖消耗量差異大，但其細(xì)胞存活率顯著降低，因此胰島素作用時(shí)間選擇36 h。

表6 1×10?7 mol/L 胰島素作用不同時(shí)間后葡萄糖消耗量Table 6 Glucose consumption of cells after 1×10?7 mol/L insulin treatment for different time

2.2.4.2 荔浦芋球蛋白對IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響 由表7 可知，與對照組相比，模型組的葡萄糖消耗量顯著降低，表明造模成功，可用于進(jìn)一步研究，二甲雙胍組和球蛋白組糖消耗量明顯大于模型組，隨球蛋白濃度的增加葡萄糖消耗量也增加，說明在該濃度范圍內(nèi)，葡萄糖消耗與荔浦芋球蛋白存在量效關(guān)系。當(dāng)球蛋白濃度達(dá)到500 μg/mL 時(shí)，葡萄糖消耗增加率達(dá)到40.62%±0.98%，陽性對照62.89%±0.71%，說明荔浦芋球蛋白能促進(jìn)IR-HepG2 對葡萄糖的消耗。CCK8 檢測結(jié)果顯示，當(dāng)球蛋白濃度為500 μg/mL，對細(xì)胞的抑制率接近20%，說明高濃度球蛋白會抑制細(xì)胞生長繁殖或?qū)?xì)胞造成損傷。

表7 荔浦芋球蛋白對IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Table 7 Effect of Lipu taro globuline on glucose consumption in IR-HepG2 cells

2.2.4.3 荔浦芋球蛋白對IR-HepG2 細(xì)胞肝糖原合成量和HK、PK 活性的影響 由表8 可知，模型組的肝糖原合成量和HK、PK 活性均顯著小于對照組（P<0.01），表明造模成功。與模型組相比，二甲雙胍能極顯著增加肝糖原合成量和HK、PK 活性（P<0.01）；荔浦芋球蛋白極顯著增加肝糖原合成量，最高可以增加28.80%±1.26%，能顯著增加PK 活性（P<0.01），最高可以增加44.29%±2.64%，能顯著增加HK活性（P<0.01），最高可以增加54.63%±2.48%。苦瓜蛋白增強(qiáng)糖尿病大鼠HK 的活性[30]，馬鹿鹿角蛋白顯著提高了糖尿病小鼠肝臟中HK 和PK 的活性[31]，鮮味多肽顯著提高小鼠的葡萄糖消耗量、HK 和PK 活性[32]，螺旋藻蛋白質(zhì)能極顯著提高胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的HK 和PK 活性[33]。綜上，活性蛋白作用于細(xì)胞表面受體通過改善胰島素信號通路，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)化為肝糖原，同時(shí)增強(qiáng)HK 和PK 活性，通過增強(qiáng)糖酵解途徑調(diào)節(jié)糖代謝。

表8 荔浦芋球蛋白對IR-HepG2 細(xì)胞肝糖原合成量、HK 和PK 活性的影響Table 8 Effect of Lipu taro globuline on liver glycogen synthesis,activity of HK and PK in IR-HepG2 cells

綜上，荔浦芋球蛋白能增加IR-HepG2 細(xì)胞的肝糖原合成量，提高HK、PK 活性，可能是通過調(diào)節(jié)糖酵解緩解因胰島素抵抗導(dǎo)致的葡萄糖吸收減少的情況，對于餐后血糖的調(diào)節(jié)具有指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

荔浦芋球蛋白變性溫度為79.30±1.36 ℃，對應(yīng)焓值為7.46±0.53 J/g，二級結(jié)構(gòu)組成含量為：β-折疊39.42%～42.14%，無規(guī)卷曲26.34%～31.38%，β-轉(zhuǎn)角18.25%～24.16%，α-螺旋5.04%～13.27%。該球蛋白富含天冬氨酸和谷氨酸，符合一般植物貯藏蛋白的規(guī)律，氨基酸評分為103.10%，必需氨基酸含量符合FAO/WHO 成人推薦標(biāo)準(zhǔn)。

本研究首次鑒定荔浦芋球蛋白二級結(jié)構(gòu)，并以IR-HepG2 細(xì)胞模型探究其對糖代謝的影響，球蛋白濃度為500 μg/mL 時(shí)，葡萄糖消耗量增加40.62%±0.98%，肝糖原合成增加率為26.35%±1.13%，PK 活性增加率為44.29%±2.64%，HK 活性增加率為54.63%±2.48%，初步證明其可以通過促進(jìn)葡萄糖吸收、增加肝糖原合成和增強(qiáng)糖酵解影響糖代謝，能顯著改善胰島素抵抗導(dǎo)致的葡糖糖吸收障礙。綜上，荔浦芋球蛋白可能是通過作用于細(xì)胞表面通過胰島素信號通路促進(jìn)胰島素分泌、增加肝糖原合成和增強(qiáng)糖酵解來影響糖代謝，其具體的作用機(jī)制需要研究胰島素抵抗信號通路中相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)來驗(yàn)證，在后續(xù)動物實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用于功能食品中時(shí)，可以通過微膠囊化等技術(shù)對蛋白進(jìn)行包埋使其避開胃腸道消化達(dá)到靶器官再發(fā)揮作用。