趙福權(quán)，王 鋮，周嘉玲，王珍珍，余 瞻，吳致鑫，沙如意,，毛建衛(wèi),2,

（1.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州 310023；2.浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江紹興 312000）

水包油型乳液是由水相與油相組成的分散體系，其中，油相以液滴的形式分散于水相中。但水包油型乳液是熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，油-水界面存在很高的界面自由能[1]，因此需要借助乳化劑降低界面自由能來維持乳液穩(wěn)定。目前在制備乳液時(shí)，常使用一些小分子表面活性劑（司班、吐溫）作為乳化劑，但這些乳化劑對人體有一定的安全隱患[2]?，F(xiàn)有大量天然物質(zhì)如磷脂、皂苷、多糖、蛋白質(zhì)等[3?5]被證實(shí)同樣具有穩(wěn)定乳液的能力。當(dāng)今社會(huì)隨著人們對食品安全意識(shí)的提升，采用具有穩(wěn)定乳液能力的食品級材料代替?zhèn)鹘y(tǒng)乳化劑的研究逐漸成為新的研究熱點(diǎn)。

米糠（Rice bran）是稻米加工副產(chǎn)物，價(jià)廉、營養(yǎng)豐富，現(xiàn)階段大部分被用作動(dòng)物飼料，造成資源的嚴(yán)重浪費(fèi)，因此，急需開發(fā)米糠精深加工產(chǎn)品。米糠蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白[6]，其氨基酸種類齊全，特別是賴氨酸、蛋氨酸含量很高，具有生物效價(jià)高、低過敏性、消化率高、營養(yǎng)價(jià)值豐富等特點(diǎn)，還具有調(diào)節(jié)身體節(jié)律[7]、提高人體免疫力等[8]作用。王可心等[9]研究表明以米糠蛋白為乳化劑穩(wěn)定的大豆油乳液具有良好穩(wěn)定性，添加0.4%的米糠蛋白，乳液的平均粒徑為5.15 μm。已有研究表明[10?11]，蛋白質(zhì)穩(wěn)定乳液的機(jī)理是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)具有兩親性，在乳液中能夠快速擴(kuò)散并吸附在油-水界面，在界面上進(jìn)一步聚合形成粘彈性保護(hù)層，降低界面自由能并避免液滴之間發(fā)生聚結(jié)和絮凝，從而使乳液達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。但米糠蛋白在乳液中的應(yīng)用還較少，其穩(wěn)定性還有待進(jìn)一步研究。

亞麻籽（Flaxseed）已存在數(shù)千年，分布于世界各地，目前我國亞麻籽分布地主要有黑龍江、內(nèi)蒙古、陜西秦嶺、山西、寧夏等，亞麻籽主要作為油料用于食品的生產(chǎn)加工中。亞麻籽油（Flaxseed oil）的主要成分為亞油酸和α-亞麻酸[12]，其中，α-亞麻酸是人體不能自身合成的不飽和脂肪酸，可以轉(zhuǎn)化為二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）[13]，具有促進(jìn)腦部發(fā)育、增強(qiáng)視覺視力，調(diào)節(jié)免疫力等[14]功效。然而亞麻籽油穩(wěn)定性較差，為解決這一問題，郭鑫等[15]以乳清蛋白為乳化劑穩(wěn)定亞麻籽油乳液，制備的乳液平均粒徑為275 nm，乳液穩(wěn)定，有利于其在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。為了解決亞麻籽油穩(wěn)定性差及稻米資源浪費(fèi)的問題，本論文以米糠蛋白為乳化劑，通過單因素考察，響應(yīng)面優(yōu)化米糠蛋白-亞麻籽油乳液的制備工藝，并對乳液進(jìn)行相關(guān)特性研究，為亞麻籽油產(chǎn)品領(lǐng)域研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米糠蛋白（純度≥97%） 陜西帕尼爾生物科技有限公司；亞麻籽油（不飽和脂肪酸90.8 g/100 g）錫林郭勒盟紅井源油脂有限責(zé)任公司一級壓榨；十二烷基硫酸鈉（化學(xué)純）、氫氧化鈉（化學(xué)純）、鹽酸（化學(xué)純）、異丙醇（分析純）、甲醇（分析純）、正丁醇（分析純）、七水合硫酸亞鐵（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸（化學(xué)純）、硫酸氫氨（化學(xué)純）、1,1,3,3-四乙氧基丙烷（化學(xué)純）、2-硫代巴比妥酸（化學(xué)純）、異辛烷（分析純） 上海阿拉丁試劑有限公司；氯化鈉（分析純） 廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司；氯化鋇（分析純） 上海松江泗聯(lián)化工廠。

FE2 實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；T-18DS25 高速剪切儀 德國IKA 有限公司；BCD-287F 冰箱 海爾電器中國有限公司；UV5500PC 紫外分光光度計(jì) 上海遠(yuǎn)析儀器有限公司；ZEN3600 馬爾文激光納米粒徑電位分析儀 上海百吉儀器系統(tǒng)有限公司；NDJ-8S 粘度計(jì) 上海衡平儀器儀表廠；FS-750T 超聲破碎儀 上海生析超生有限公司；GZX-9140MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；BX53F 奧林巴斯倒置顯微鏡上海通灝光電科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 在預(yù)實(shí)驗(yàn)確定亞麻籽油乳液油水比1:7 的條件下，采用單因素篩選法考察乳化劑米糠蛋白添加量、剪切轉(zhuǎn)速、超聲功率對乳液粒徑大小的影響。

米糠蛋白添加量對亞麻籽油乳液粒徑大小的影響：在室溫條件下，用去離子水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%的米糠蛋白溶液，此為乳液的連續(xù)相。向連續(xù)相中加入亞麻籽油，在剪切轉(zhuǎn)速為8000 r/min 條件下剪切2 min，然后在超聲功率為300 W 條件下超聲6 min 制得亞麻籽油乳液。

剪切轉(zhuǎn)速對亞麻籽油乳液粒徑大小的影響：在室溫條件下，以米糠蛋白為乳化劑，將其均勻分散于適量去離子水中，制成0.5%的米糠蛋白水溶液，此為乳液的連續(xù)相。向連續(xù)相中加入亞麻籽油，分別在6000、8000、10000、12000、14000 r/min 的條件下剪切2 min，然后在超聲功率為300 W 條件下超聲6 min 制得亞麻籽油乳液。

超聲功率對亞麻籽油乳液粒徑大小的影響：在室溫條件下，以米糠蛋白為乳化劑，將其均勻分散于適量去離子水中，制成0.5%的米糠蛋白水溶液，此為乳液的連續(xù)相。向連續(xù)相中加入亞麻籽油，在剪切轉(zhuǎn)速為8000 r/min 條件下剪切2 min，然后分別在200、250、300、350、400 W 的超聲功率條件下超聲6 min 制得亞麻籽油乳液。

1.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取米糠蛋白添加量、剪切轉(zhuǎn)速以及超聲功率為考察因素，以亞麻籽油乳液的平均粒徑（Y）為響應(yīng)值，利用Design expert 8.05b 軟件進(jìn)行3 因素3 水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Test factors and level design of response surface methodology

1.2.3 亞麻籽油乳液特性研究 在響應(yīng)面試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用最優(yōu)條件制備亞麻籽油乳液，考察pH、離子強(qiáng)度、溫度對亞麻籽油乳液穩(wěn)定性的影響；并通過乳化活性、乳化穩(wěn)定性、初級氧化產(chǎn)物、次級氧化產(chǎn)物、乳液流變特性和乳液微觀結(jié)構(gòu)的測定，進(jìn)一步對制備的乳液進(jìn)行理化特性分析。

1.2.3.1 pH 穩(wěn)定性 參照馮鑫等[16]的方法，取亞麻籽油乳液10 mL，分別調(diào)整pH 為3、5、7、9、11，考察乳液的粒徑及電位在不同pH 條件下隨貯藏時(shí)間變化的情況，分析pH 對乳液影響。

1.2.3.2 離子穩(wěn)定性 參照馮鑫等[16]的方法并稍加修改，取亞麻籽油乳液10 mL，調(diào)整pH 為9，向其中加入NaCl，使得乳液中的鈉離子強(qiáng)度分別為0、100、200、300、400、500 mmol/L，考察乳液的粒徑及電位在不同鈉離子強(qiáng)度條件下隨貯藏時(shí)間變化的情況，分析鈉離子對乳液影響。

1.2.3.3 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性 參照馮鑫等[16]的方法并稍加修改，取亞麻籽油乳液各10 mL，調(diào)整pH 為9，加入NaCl 使其濃度為100 mmol/L，分別置于4、25 ℃下保存，考察乳液的粒徑及電位在此條件下隨貯藏時(shí)間變化的情況，并觀察亞麻籽油乳液的分層情況。

1.2.3.4 乳化活性（EAI）及乳化穩(wěn)定性（ESI） 參照Sui 等[17]的方法，利用0.1%十二烷基硫酸鈉將乳液樣品稀釋至0.05 mg/mL，在500 nm 波長處測定初始狀態(tài)的吸光度（A0）和放置30 min 后的吸光度（A30），根據(jù)下式計(jì)算乳化活性和乳化穩(wěn)定性：

式中：N 為樣品稀釋倍數(shù)；C 為米糠蛋白質(zhì)量濃度（g/mL）；φ 為油水比。

1.2.3.5 初級氧化產(chǎn)物（POV）含量的測定 參照Kargar 等[18]的方法，以氫過氧化物含量表示亞麻籽油乳液和亞麻籽油的初級氧化產(chǎn)物含量。取200 μL樣品加入3 mL 異辛烷-異丙醇混合液（體積比3:1），充分振蕩均勻后在5000 r/min 條件下離心，取上層溶液并加入甲醇-正丁醇混合液（體積比2:1）至3 mL，最后加入0.3 g/mL 硫氰酸銨15 μL、0.264 mol/L 氯化鋇和0.288 mol/L 硫酸亞鐵混合液（體積比1:1）15 μL，室溫靜置20 min，在500 nm 波長處測定吸光值。

1.2.3.6 次級氧化產(chǎn)物（TBARS）含量的測定 參照Zhao 等[19]的方法，取2 mL 亞麻籽油乳液，加入5%三氯乙酸和0.02 mol/L 硫代巴比妥酸的混合液（體積比1:1）4 mL，充分混勻，95 ℃恒溫水浴15 min，快速冷卻至室溫，12000 r/min 離心20 min 后取上清液，靜置20 min，在波長532 nm 處測其吸光度。

1.2.3.7 乳液流變特性的測定 參照Dokic 等[20]的方法，在溫度25 ℃，平衡時(shí)間30 s，剪切速率1～100 s?1，測定時(shí)間60 s 的條件下，通過NDJ-8S 型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測定亞麻籽油乳液的流變行為，以表觀黏度為測定指標(biāo)。

1.2.3.8 乳液微觀結(jié)構(gòu)測定 參照張會(huì)等[21]的方法，吸取20 μL 亞麻籽油乳液樣品于干凈載玻片上，輕蓋蓋玻片，防止液滴破裂，并確保內(nèi)部無氣泡，用BX53F型倒置光學(xué)顯微鏡在10 倍目鏡、40 倍物鏡條件下觀察乳液液滴形狀。利用儀器自帶軟件獲得乳液顯微結(jié)構(gòu)圖像。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019、SPSS 22、Design-Expert v8 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及處理，用Origin 2017 繪制圖，圖表中誤差均為標(biāo)準(zhǔn)誤差，所有試驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 米糠蛋白添加量對乳液粒徑的影響 已有研究表明，粒徑越小的乳液穩(wěn)定性越好[22]。米糠蛋白添加量對粒徑影響結(jié)果見圖1，隨著米糠蛋白添加量的增加，乳液粒徑先降低后增加；當(dāng)其添加量為0.5%時(shí)，乳液粒徑最小，為291.6 nm。這可能是隨著乳化劑用量的增加，表面張力逐漸下降[23]，亞麻籽油乳液的乳化的程度不斷增大，乳化效果好，制得的乳液粒徑小，而隨著米糠蛋白用量的進(jìn)一步增加，乳液液滴的表面電荷不足以克服蛋白質(zhì)分子間的相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致乳液絮凝現(xiàn)象發(fā)生[24]，導(dǎo)致粒徑增大。因此，選用0.5%米糠蛋白添加量進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

圖1 米糠蛋白添加量對亞麻籽油乳液粒徑的影響Fig.1 Effect of rice bran protein addition on particle size of flaxseed oil emulsion

2.1.2 剪切轉(zhuǎn)速對乳液粒徑的影響 剪切轉(zhuǎn)速對乳液粒徑影響結(jié)果如圖2 所示，隨著剪切轉(zhuǎn)速的增大，粒徑先減小后增大，在剪切轉(zhuǎn)速為8000 r/min 時(shí)，粒徑最小，達(dá)到310.4 nm。造成粒徑變化的原因可能是較低的攪拌速度不能使油相完全分散在水相中，而攪拌轉(zhuǎn)度過快，會(huì)使乳液剪切力過大，將機(jī)械能轉(zhuǎn)換成熱能傳遞給乳液，造成乳液溫度上升，進(jìn)而破壞分子間的作用力和界面膜的穩(wěn)定性，還會(huì)使得油滴運(yùn)動(dòng)加快，造成碰撞凝聚結(jié)成大顆粒導(dǎo)致粒徑增大[25]。為了保證亞麻籽油能夠得到充分乳化又不消耗過多的機(jī)械能，故選擇剪切轉(zhuǎn)速為8000 r/min 進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

圖2 剪切轉(zhuǎn)速對亞麻籽油乳液粒徑的影響Fig.2 Effect of rotational speed on particle size of flaxseed oil emulsion

2.1.3 超聲功率對乳液粒徑的影響 超聲功率對乳液粒徑影響結(jié)果見圖3，隨著超聲功率的增加，乳液粒徑先減小后增大，在不同的超聲功率下粒徑大小差別明顯。在300 W 的條件下得到粒徑最小，為345.9 nm。造成這一現(xiàn)象的原因可能是超聲功率過小不能將高速剪切過后制備的粗乳液進(jìn)一步乳化為細(xì)乳液，而功率太大，導(dǎo)致體系溫度上升，進(jìn)而破壞分子間的作用力和界面穩(wěn)定性[26]，造成粒徑升高。因此，選用超聲功率300 W 進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

圖3 超聲功率對亞麻籽油乳液粒徑的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on particle size of flaxseed oil emulsion

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 建立米糠蛋白添加量、剪切轉(zhuǎn)速、超聲功率對粒徑影響的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見表2，采用Design-expert 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到如下回歸方程為：

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Design and result of Box-Behnken experience

對響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3，此模型極其顯著（P<0.0001），失擬項(xiàng)F值為2.34，P值為0.2145，不顯著（P>0.05），說明回歸方程對實(shí)際情況來說吻合較好，誤差極小，故可用回歸方程對響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。模型決定系數(shù)R2為0.9095，決定系數(shù)為R2Adj為0.9063，說明該回歸方程的擬合度及穩(wěn)定性較好。因此，用此模型對乳液穩(wěn)定進(jìn)行優(yōu)化是合適的。模型回歸系數(shù)顯著性分析顯示，一次項(xiàng)A、C 高度顯著（P<0.01），交互項(xiàng)BC 和二次項(xiàng)A2、B2、C2極其顯著（P<0.0001）。模型中各因素的F值反映了各因素對響應(yīng)值Y 的影響程度。F值越大，說明此因素對響應(yīng)面的影響越大。由表3 可知，F(xiàn)A=26.50，F(xiàn)B=6.54，F(xiàn)C=21.43，即三種因素對乳液粒徑、穩(wěn)定性影響程度大小順序?yàn)椋篈（米糠蛋白添加量）>C（超聲功率）>B（剪切轉(zhuǎn)速）。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results

2.2.2 各因素交互作用分析 由圖4a 可知，過高或過低的米糠蛋白添加量都不可形成較小粒徑的乳液。超聲功率保持不變，隨著米糠蛋白添加量的增大，乳液粒徑先減小后增大，米糠蛋白添加量在0.45%～0.6%范圍內(nèi)時(shí)，乳液粒徑出現(xiàn)最小值。由圖4b 可知，乳液粒徑隨著剪切轉(zhuǎn)速的增大呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢，剪切轉(zhuǎn)速的大小直接影響了乳液的乳化程度，適宜的剪切轉(zhuǎn)速大小為7600～8400 r/min。由圖4c可知，當(dāng)米糠蛋白添加量恒定時(shí)，隨著超聲功率的增大，乳液粒徑同樣呈現(xiàn)出先減小后增大的趨勢，且趨勢的變化較慢。在超聲功率300～350 W 范圍內(nèi)，有利于乳液粒徑的減小。此研究結(jié)果與單因素結(jié)果具有一致性，證明模型是可信的。

圖4 各因素交互作用對乳液粒徑影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface diagram of the interaction of various factors on the particle size of emulsion

2.2.3 優(yōu)化結(jié)果的驗(yàn)證 經(jīng)Design Expert 軟件分析得出亞麻籽油乳液最優(yōu)的制備條件為：米糠蛋白的添加量為0.56%，超聲功率為306.76 W，剪切轉(zhuǎn)速為7929.97 r/min，預(yù)測乳液的平均粒徑為306.76 nm。結(jié)合實(shí)際操作可能性，調(diào)整工藝參數(shù)為：米糠蛋白的添加量為0.56%，超聲功率為300 W，剪切轉(zhuǎn)速為7900 r/min，在此條件下驗(yàn)證此模型的可靠性，經(jīng)3 次平行實(shí)驗(yàn)測定乳液的平均粒徑為315.14 nm，與軟件預(yù)測值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%，表明該響應(yīng)面能準(zhǔn)確預(yù)測出該工藝中三個(gè)因素對乳液粒徑的影響。

2.3 亞麻籽油乳液理化特性

2.3.1 pH 穩(wěn)定性 有研究表明，不同pH 對蛋白質(zhì)為乳化劑制備的乳液所帶電荷量影響程度不同[27]。本文對優(yōu)化條件下制備得到的乳液進(jìn)行理化性質(zhì)的表征，不同pH 條件下，乳液的粒徑、Zeta 電位隨時(shí)間的變化見圖5。從圖5 中可以看出隨著pH 的增加，乳液的粒徑呈先增大后減小的趨勢，pH 為7 時(shí)乳液粒徑最大；當(dāng)pH 繼續(xù)增大時(shí)，乳液粒徑減小，這是由于乳液中液滴表面靜電荷量增大，液滴之間的靜電斥力增大，促使液滴之間保持平衡而不發(fā)生聚集。在pH 為9 時(shí)乳液的粒徑最小，電位波動(dòng)幅度最小，證明其穩(wěn)定性好；在第7 d 時(shí)，pH 為5 的乳液電位絕對值最小，這可能是因?yàn)榈鞍兹芤旱膸щ娮兓闆r與蛋白中氨基和羧基之間的電離平衡有關(guān)，溶液整體帶電性影響乳液的穩(wěn)定性，在強(qiáng)酸性條件下蛋白質(zhì)與液滴之間相互排斥作用小，易發(fā)生聚集，使Zeta 電位電勢下降，進(jìn)而造成乳液不穩(wěn)定[28]，這一結(jié)果與方振興等[29]研究的pH 對橄欖油Pickering 乳液穩(wěn)定性影響的趨勢一致。除pH 為3 外，乳液的電位絕對值隨著pH 增大而增大，可能是米糠蛋白等電點(diǎn)位于pH4.1，隨著pH 上升，乳液中蛋白質(zhì)所帶電荷量增大，提供了相對較強(qiáng)的電荷排斥作用，使得液滴不易聚集，乳液較為穩(wěn)定。

圖5 不同pH（3～11）對亞麻籽油乳液穩(wěn)定性（粒徑和乳液電位）的影響Fig.5 Influence of pH (3～11) on the stability of flaxseed oil emulsion (particle size and emulsion potential)

2.3.2 離子穩(wěn)定性 本文中Na+對乳液的影響情況如圖6 所示。低濃度的Na+可以降低蛋白溶解度但不會(huì)聚集，這有助于提高乳液的穩(wěn)定性。隨著Na+濃度增大，乳液粒徑增大，這可能是因?yàn)殡x子通過靜電作用屏蔽了蛋白質(zhì)的表面電荷，促進(jìn)了乳液液滴的聚集，不利于蛋白質(zhì)在油滴表面的吸附及重排，從而導(dǎo)致乳液粒徑增加[30]。在前期實(shí)驗(yàn)中，作者已測得米糠蛋白等電點(diǎn)為4.1。從圖6 中可以看出隨著離子濃度越大，Zeta 電位的絕對值隨著時(shí)間延長波動(dòng)越大，這種現(xiàn)象可能是因?yàn)樵趐H 為9 條件下制備的亞麻籽油乳液中含有帶正電Na+會(huì)與帶負(fù)電荷蛋白結(jié)合，使油滴表面負(fù)電荷減少；另一種原因可能是隨著離子濃度增大，被中和電荷增多，減小了靜電作用，導(dǎo)致電荷數(shù)下降，最終造成乳液的穩(wěn)定性下降[31]。本文在100 mmol Na+條件下制備的乳液粒徑變化最小，電位波動(dòng)較小。在此條件下的乳液與張小影等[32]研究鹽離子對大豆-乳清混合蛋白乳液相比，粒徑降低了13.83%，證明米糠蛋白制備的乳液穩(wěn)定性更加優(yōu)異。

圖6 不同Na+濃度（0～500 mmol/L）對亞麻籽油乳液穩(wěn)定性（粒徑和乳液電位）的影響Fig.6 Influence of different Na+ concentrations (0～500 mmol/L)on the stability of flaxseed oil emulsion (particle size and emulsion potential)

2.3.3 冷藏穩(wěn)定性 通過觀察乳液分層情況判斷乳液儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，如果乳液不分層，不出現(xiàn)乳析現(xiàn)象，則證明穩(wěn)定性良好，若伴有溢油現(xiàn)象，則乳液穩(wěn)定性不佳[33]。由圖7 可知，在4 ℃冷藏條件下，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，乳液粒徑逐漸增大；圖8 可以看出乳液在55 d 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，從第60 d 開始乳液開始有分層的趨勢，并伴有溢油現(xiàn)象的發(fā)生，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能在于隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)分子不足以維持油水界面平衡，由于重力作用開始有溢油現(xiàn)象的發(fā)生，重力分離是食品乳液中常見的不穩(wěn)定形式之一，油滴在重力因素影響下，移動(dòng)更快而更易發(fā)生相互碰撞，導(dǎo)致乳液粒徑增大[34]，進(jìn)而使其產(chǎn)生了分層現(xiàn)象。靜電斥力的降低以及聚并作用力增強(qiáng)，使得油滴間相互吸引而發(fā)生聚集，乳液Zeta 電位電勢下降，促使乳液的穩(wěn)定性降低[35]。

圖7 4 ℃條件下亞麻籽油乳液的穩(wěn)定性Fig.7 Stability of flaxseed oil emulsion at 4 ℃

圖8 4 ℃條件亞麻籽油乳液分層情況Fig.8 Stratification of flaxseed oil emulsion at 4 ℃

2.3.4 室溫貯藏穩(wěn)定性 將新制備的亞麻籽油乳液置于室溫下儲(chǔ)存，其粒徑和電位的變化見圖9，從圖中可以看出隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長，粒徑呈先緩慢增加后快速增加的趨勢，前期粒徑增長緩慢的原因可能是亞麻籽油被包裹在液滴內(nèi)，大大降低了分子運(yùn)動(dòng)性[36]。從圖10 可以看出，在10 d 內(nèi)，乳液具有良好的穩(wěn)定性，第15 d 時(shí)，乳液出現(xiàn)分層的現(xiàn)象，第20 d 時(shí)乳液的水層高度增加并變清晰，分層明顯。造成此現(xiàn)象的原因可能是隨著時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)不足以維持油水的界面能，降低了界面的靜電作用力；另一種原因可能是重力作用和粒子的布朗運(yùn)動(dòng)也導(dǎo)致了乳液的聚結(jié)，從而導(dǎo)致乳液的水層厚度與乳液總高度的比值均升高[37]。隨著存儲(chǔ)時(shí)間的延長，油水界面不再平衡，靜電作用減小，Zeta 電位絕對值逐漸降低，進(jìn)而發(fā)生了乳析現(xiàn)象。

圖9 25 ℃條件下亞麻籽油乳液的穩(wěn)定性Fig.9 Stability of flaxseed oil emulsion at 25 ℃

圖10 25 ℃條件亞麻籽油乳液分層情況Fig.10 Stratification of flaxseed oil emulsion at 25 ℃

2.3.5 乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）分析 乳液的乳化活性和乳化穩(wěn)定性是反映乳液特性的重要指標(biāo)。乳化活性越高，表明蛋白質(zhì)越能夠抑制油滴的聚集，從而形成穩(wěn)定的乳液[38]。乳化穩(wěn)定性則表明乳液保持穩(wěn)定的性能，數(shù)值越大，性能越好。如圖11所示，在最優(yōu)條件下制備的亞麻籽油乳液具有良好的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。常慧敏等[39]研究米糠蛋白-大豆油O/W 型納米乳液，測定的乳化活性為19.97 m2/g，乳化穩(wěn)定性168 min，均低于本文亞麻籽油乳液的乳化特性。本文乳液乳化活性更加優(yōu)越的原因可能是適量的米糠蛋白在形成乳液過程中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分折疊從而暴露出更多疏水基團(tuán)包裹在油滴周圍防止其聚集，乳液形成了穩(wěn)定的油-水界面膜[40]，使得乳液具有良好的乳化活性；有研究表明[41]，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的pH 偏離等電點(diǎn)時(shí)溶解性會(huì)增大，所帶電荷增加，蛋白分子柔性和分散性更好，使得乳液的乳化穩(wěn)定性得以提高。此外Perazzo 等[42]已證實(shí)乳化活性與乳化穩(wěn)定性是密切相關(guān)的，乳化活性越高，意味著乳化劑能形成更大的乳化界面，有助于減小油脂析出現(xiàn)象的發(fā)生，增加了乳化穩(wěn)定性[43]。這可能是亞麻籽油乳液乳化穩(wěn)定性更加優(yōu)越的原因。

圖11 亞麻籽油乳液乳化活性和乳化穩(wěn)定性Fig.11 Emulsifying activity and stability of flaxseed oil emulsion

2.3.6 初級氧化產(chǎn)物（POV）含量的測定 乳液中油脂的酸敗是影響乳液品質(zhì)的重要因素，如圖12 所示，隨著氧化時(shí)間的延長，POV 的含量也隨之增大。在亞麻籽油氧化初期，氫過氧化物逐漸形成，過氧化值逐漸升高，這是致使乳液品質(zhì)下降的重要因素。與亞麻籽油相比，亞麻籽油乳液在儲(chǔ)存過程中的POV值較低，在第7 d 時(shí)，POV 值降低了0.026 mmoL/L，表明米糠蛋白對乳液中油脂氫過氧化物的形成有很好的抑制作用，這與易建華等[44]研究大豆分離蛋白對乳液初級氧化產(chǎn)物影響效果一致。可見，米糠蛋白穩(wěn)定的亞麻籽油乳液在初級氧化過程中更加穩(wěn)定。

圖12 亞麻籽油乳液初級氧化產(chǎn)物Fig.12 Primary oxidation products of flaxseed oil emulsion

2.3.7 次級氧化產(chǎn)物（TBARS）含量的測定 次級氧化是初級氧化產(chǎn)物進(jìn)一步分解為醛、酸、醇等小分子產(chǎn)物的過程。由圖13 可知，乳液次級氧化產(chǎn)物含量隨著時(shí)間延長，呈先快速上升后緩慢上升趨勢。在第2 d時(shí)亞麻籽油次級氧化產(chǎn)物數(shù)值增大速率明顯，相比之下亞麻籽油乳液數(shù)值變化較小，這可能是乳液中亞麻籽油被均勻分散在水相中，能有效阻隔亞麻籽油與空氣中氧氣直接接觸，所以乳液氧化速度降低[45]。從第2 d 開始，乳液TBARS 數(shù)值均低于亞麻籽油，同初級氧化產(chǎn)物有相同變化趨勢，在第7 d 時(shí)其數(shù)值降低了0.031 mg/kg，這可能是因?yàn)槿橐褐械牡鞍踪|(zhì)吸附在油滴表面后形成一層黏彈性蛋白膜，蛋白膜可以有效阻止脂質(zhì)氧化的引發(fā)劑擴(kuò)散到油滴內(nèi)部，從而起到抑制油脂氧化的作用[46]。Ries 等[47]的研究也表明，蛋白穩(wěn)定的乳液在貯藏過程中能抑制脂質(zhì)過氧化物和揮發(fā)性脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的生成，與本文的試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖13 亞麻籽油乳液次級氧化產(chǎn)物Fig.13 Secondary oxidation products of flaxseed oil emulsion

2.3.8 乳液流變特性的測定 如圖14 所示，亞麻籽油乳液的黏度隨著剪切速率增大而降低，表現(xiàn)出典型的剪切稀釋現(xiàn)象，符合非牛頓流體特性[48]。造成黏度變化的原因可能是隨著剪切速率的增加，乳液的內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞，油水界面的相互作用力和范德華力減弱，使蛋白亞基之間的二硫鍵發(fā)生斷裂，蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)部分展開，改變了蛋白質(zhì)緊密的三維結(jié)構(gòu)，增大了流體的流動(dòng)性，進(jìn)而使得表觀黏度降低[49]。

圖14 亞麻籽油乳液流變特性Fig.14 Rheological properties of flaxseed oil emulsion

2.3.9 乳液微觀結(jié)構(gòu)的測定 如圖15 所示，亞麻籽油乳液在光學(xué)顯微鏡放大400 倍條件下可觀察到存在球形油滴分布的情況，大小分布略不統(tǒng)一，尺寸在幾百納米到1 μm 之間。出現(xiàn)大部分油滴尺寸較小的原因可能是大部分蛋白分子的疏水部分可以更多的探入到油滴內(nèi)部，在剪切乳化過程中，只需要少量的蛋白分子即可穩(wěn)定乳液，因此形成的油滴尺寸會(huì)更小[50?51]；少部分蛋白分子與油滴接觸時(shí)接觸面積較小，只能達(dá)到瞬時(shí)穩(wěn)定的效果，一段時(shí)間后，油滴與油滴之間發(fā)生絮凝進(jìn)而導(dǎo)致尺寸變大[52]。

圖15 亞麻籽油乳液光學(xué)顯微鏡圖像Fig.15 Optical microscope image of flaxseed oil emulsion

3 結(jié)論

以亞麻籽油為油相，米糠蛋白為乳化劑，采用高速剪切法制備（O/W 型）乳液。通過單因素實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面試驗(yàn)對制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，隨后對制備的乳液進(jìn)行穩(wěn)定性及理化特性測定，結(jié)果表明最佳制備工藝：米糠蛋白添加量0.56%、剪切轉(zhuǎn)速7900 r/min、超聲功率300 W，在此條件下制得的亞麻籽油乳液的平均粒徑為315.14 nm。對其穩(wěn)定性評價(jià)表明：乳液在4 ℃冷藏儲(chǔ)存55 d 內(nèi)和25 ℃室溫儲(chǔ)存10 d 內(nèi)均呈現(xiàn)出良好的穩(wěn)定特性，乳化活性及穩(wěn)定性的測定也證實(shí)了乳液具有抑制油滴聚集、保持穩(wěn)定的特性，氧化產(chǎn)物的測定證明其具有一定的抑制氧化能力。本文以米糠蛋白為乳化劑制備亞麻籽油乳液的研究提高了米糠蛋白的利用價(jià)值，減少了資源的浪費(fèi)，為稻米加工副產(chǎn)物的應(yīng)用提供新思路；為亞麻籽油產(chǎn)品在食品領(lǐng)域的推廣提供一定的理論參考；為新型功能性飲品的開發(fā)提供了科學(xué)支撐。