鄭乾明，王小柯，馬玉華

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)科學(xué)研究所，貴陽(yáng) 550006)

【研究意義】紅肉火龍果果實(shí)色澤鮮艷，其含有的甜菜色素既能作為天然食用色素[1-2]，又具有淬滅自由基的活性，在抗氧化、抑制癌細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等具有應(yīng)用價(jià)值[3-6]。紅肉火龍果果實(shí)中的甜菜色素主要為甜菜紅素和甜菜黃素，甜菜紅素是決定紅肉火龍果果實(shí)成熟時(shí)色澤的主要色素[7-9]。研究紅肉火龍果果實(shí)甜菜紅素的積累，分離代謝途徑關(guān)鍵基因，有利于闡明紅肉火龍果果實(shí)甜菜紅素積累的分子機(jī)制，對(duì)調(diào)控果實(shí)甜菜紅素含量，改良果實(shí)商品價(jià)值具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】甜菜紅素的生物合成以酪氨酸為前體，經(jīng)過(guò)羥基化和氧化等形成重要的中間產(chǎn)物L(fēng)-3,4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)和甜菜醛氨酸[4,10-11]。最早在甜菜(Betavulgaris)中克隆獲得細(xì)胞色素P450家族成員BvCYP76AD1基因，其蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核[12]，通過(guò)基因干涉表達(dá)和酵母異源表達(dá)研究均證明BvCYP76AD1介導(dǎo)L-DOPA生成cyclo-DOPA[13]。紫茉莉(Mirabilisjalapa)MjCYP76AD3是BvCYP76AD1的直系同源基因，其基因表達(dá)量與甜菜紅素含量顯著相關(guān)[14]。通過(guò)化學(xué)誘變劑處理，從藜麥(ChenopodiumquinoaWilld)分離CqCYP76AD1-1基因，其表達(dá)與下胚軸甜菜紅素積累有關(guān)，突變后喪失酶活性，甜菜紅素不積累[15]。近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)，BvCYP76AD1介導(dǎo)酪氨酸羥基化形成L-DOPA，是甜菜紅素合成途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵反應(yīng)[16]。紅肉火龍果果實(shí)甜菜色素積累主要在授粉的24～28 d[17-20]。近年來(lái)發(fā)布火龍果基因組序列[21-22]，利用Illumina平臺(tái)的第二代高通量測(cè)序?qū)麑?shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析表明，CYP76AD1相關(guān)基因部分序列受轉(zhuǎn)錄因子HpWRKY44的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控[17, 23-24]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】當(dāng)前未有報(bào)道火龍果CYP76AD1基因的序列全長(zhǎng)，不能開(kāi)展基因功能等分析。因此，通過(guò)果實(shí)成熟期間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)合RT-PCR和測(cè)序，分離紅肉火龍果CYP76AD1相關(guān)基因?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】獲得火龍果HpCYP76AD1基因全長(zhǎng)，分析其序列特征和基因表達(dá)模式，為明確其在果實(shí)甜菜紅素合成途徑中的生理功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

紅肉火龍果品種為“紫紅龍”，采集于貴州省安順市鎮(zhèn)寧縣的火龍果種植園。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)樣品制備 將火龍果“紫紅龍”人工授粉當(dāng)天記為0 d，于授粉的20，23，25，27和30 d采集火龍果果實(shí)樣品，每個(gè)時(shí)期采集9個(gè)果實(shí)，每3個(gè)果實(shí)為1次重復(fù)，共3次重復(fù)。取果肉切成厚度約0.5 cm的薄片，液氮速凍。所有樣品均在-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 甜菜色素含量檢測(cè) 火龍果果肉甜菜紅素提取和含量檢測(cè)參考Hua等[17]的方法，果肉甜菜紅素相對(duì)含量利用分光光度計(jì)檢測(cè)。

1.2.3 RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 利用Trizol試劑盒(Invitrogen，USA)提取火龍果果肉總RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000分別檢測(cè)其質(zhì)量和濃度。共計(jì)15份果肉樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，文庫(kù)構(gòu)建、序列注釋和數(shù)據(jù)分析參見(jiàn)此前描述[25]。

1.2.4 RT-PCR擴(kuò)增和測(cè)序 取1.0 μg合格樣品，利用RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒(Fermentas，USA)合成cDNA第一鏈。使用Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)引物HpCYP76AD1-ORF-F和HpCYP76AD1-ORF-R(表1)用于RT-PCR擴(kuò)增。以授粉30 d的果肉總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為PCR模板。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后回收，產(chǎn)物連接到克隆載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 ORF預(yù)測(cè)使用ORF Finder程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)，理論等電點(diǎn)和相對(duì)分子量預(yù)測(cè)使用ExPASy程序(https://web.expasy.org/compute_pi/)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用PredictProtein(https://www.predictprotein.org)。利用Clustal W軟件進(jìn)行序列比對(duì)，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建基于鄰接法的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap值進(jìn)行1000次重復(fù)檢驗(yàn)。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè) 根據(jù)HpCYP76AD1基因序列，使用Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)引物HpCYP76AD1-qRT-F和HpCYP76AD1-qRT-R(表1)。利用CFX ConnectTMReal-Time PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系總體積為20.0 μL，包括cDNA模板 1.0 μL，引物1.6 μL，SYBR Green PCR 混合體系(Applied Biosystems，USA)10.0 μL和ddH2O 7.4 μL。擴(kuò)增程序如下：95 ℃變性3 min;5 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸 20 s，共40次循環(huán)。使用HpPTBP-F和HpPTBP-R作為內(nèi)參基因(序列未發(fā)表)?；蛳鄬?duì)表達(dá)量使用公式2-ΔΔCt計(jì)算，以授粉20 d的基因表達(dá)量設(shè)為“1”。

表1 HpCYP76AD1基因擴(kuò)增和表達(dá)檢測(cè)的相關(guān)引物序列Table 1 Relative primer sequences for amplification and expression detection of HpCYP76AD1 gene

2 結(jié)果與分析

2.1 果實(shí)甜菜紅素含量

從圖1看出，授粉20～25 d火龍果果肉的甜菜紅素含量略有增加。授粉27 d后，甜菜紅素顯著積累；授粉30 d時(shí)甜菜紅素含量大幅度增加，含量約為20 d的150倍。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Different lowercase letters indicate significant different at P<0.05 level. The same as below圖1 紅肉火龍果果實(shí)發(fā)育和成熟期間甜菜紅素的相對(duì)含量Fig.1 The relative content of betacyanin at development and ripening stages of H. polyrhizus fruits

2.2 HpCYP76AD1基因克隆

對(duì)紅肉火龍果果實(shí)發(fā)育至成熟的5個(gè)時(shí)期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，獲得1條長(zhǎng)度為2577 bp的Unigene，與甜菜CYP76AD1基因編碼的氨基酸序列相似性為81%。該Unigene與前期報(bào)道的1個(gè)CYP76AD1相關(guān)Unigene(編號(hào)為c31181_g1)核苷酸序列[25]一致性為100%，說(shuō)明兩者為同一基因。c31181_g1在果實(shí)中特異性表達(dá)，其表達(dá)量約是莖中的2000倍。該Unigene序列含有一條長(zhǎng)度為1521 bp的ORF序列，編碼長(zhǎng)度為506個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)序列。設(shè)計(jì)RT-PCR引物擴(kuò)增，然后克隆和測(cè)序獲得其ORF序列。

2.3 HpCYP76AD1蛋白序列

對(duì)HpCYP76AD1基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，其理論等電點(diǎn)為8.86，相對(duì)分子量為57.5 kDa。將該序列在NCBI中再次進(jìn)行blastx檢索發(fā)現(xiàn)，其與梨果仙人掌OfCYP76AD8的序列相似度最高，達(dá)89.96%(表2)。

表2 HpCYP76AD1與其他同源基因序列的相似性Table 2 Sequence similarity of HpCYP76AD1 and other homologous genes

將HpCYP76AD1與甜菜、紫茉莉和梨果仙人掌等相關(guān)基因，使用氨基酸序列構(gòu)建基于鄰接法的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。上述基因明顯分為兩類(lèi)，根據(jù)Sunnadeniya等[16]和Brockington等[26]對(duì)CYP76AD1家族成員的分類(lèi)，HpCYP76AD1與梨果仙人掌OfCYP76AD8、紫茉莉MjCYP76AD3、甜菜BvCYP76AD1和紫色莧菜花AcCYP76AD2為α類(lèi)，紫茉莉MjCYP76AD15、甜菜BvCYP76AD5和BvCYP76AD6為β類(lèi)，HpCYP76AD1與來(lái)自仙人掌科梨果仙人掌的OfCYP76AD8親緣關(guān)系最近。

圖2 HpCYP76AD1與其他相關(guān)基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of HpCYP76AD1 and other related genes

2.4 HpCYP76AD1基因表達(dá)

從圖3看出，授粉20～25 d期間HpCYP76AD1基因表達(dá)量增加。授粉27 d的基因表達(dá)量約為授粉20 d的1500倍，此后到果實(shí)完全成熟(授粉30 d)的表達(dá)量約為授粉20 d的1650倍。利用qRT-PCR檢測(cè)的基因表達(dá)結(jié)果與RNA-seq結(jié)果基本一致。

圖3 紅肉火龍果HpCYP76AD1基因在果實(shí)成熟期間的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Expression pattern of HpCYP76AD1 gene of H. polyrhizus during fruit ripening

3 討 論

L-酪氨酸羥基化產(chǎn)生L-DOPA，以及L-DOPA羥基化產(chǎn)生cyclo-DOPA是甜菜色素合成途經(jīng)中的兩個(gè)關(guān)鍵上游步驟。甜菜BvCYP76AD1基因于2012年首次克隆，在甜菜中干涉或超量表達(dá)該基因均影響甜菜紅素含量，通過(guò)酵母工程菌株表達(dá)驗(yàn)證其介導(dǎo)L-DOPA羥基化產(chǎn)生cyclo-DOPA[13]。此后，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)BvCYP76AD1、BvCYP76AD5和BvCYP76AD6均具有催化L-酪氨酸羥基化產(chǎn)生L-DOPA的活性，但BvCYP76AD5和BvCYP76AD6不能催化L-DOPA羥基化產(chǎn)生cyclo-DOPA[16]。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，BvCYP76AD1、MjCYP76AD3和AcCYP76AD2屬于α類(lèi)，BvCYP76AD5和BvCYP76AD6屬于β類(lèi)。α和β類(lèi)都具有催化L-酪氨酸羥基化產(chǎn)生L-DOPA的能力，存在功能冗余。同時(shí)α類(lèi)在進(jìn)化中又產(chǎn)生催化L-DOPA羥基化形成cyclo-DOPA的能力。本研究獲得的紅肉火龍果HpCYP76AD1屬于α類(lèi)，因此具有上述2個(gè)羥基化反應(yīng)的能力。

CYP76AD1基因的表達(dá)與甜菜紅素含量呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)關(guān)系。紫茉莉不同發(fā)育時(shí)期的花被中，甜菜紅素含量隨CYP76AD3基因上調(diào)表達(dá)明顯增加[14]。藜麥下胚軸中經(jīng)光照刺激產(chǎn)生甜菜紅素，CYP76AD1-1基因大量表達(dá)，說(shuō)明CYP76AD1-1基因與甜菜紅素積累密切相關(guān)[15]。紅肉火龍果果實(shí)在成熟過(guò)程中甜菜紅素大量積累，HpCYP76AD1基因在果實(shí)特異表達(dá)，且隨果實(shí)成熟顯著上調(diào)，說(shuō)明甜菜HpCYP76AD1基因參與果實(shí)甜菜紅素積累。下一步需要驗(yàn)證其催化活性及調(diào)控機(jī)制，為明確火龍果果實(shí)甜菜紅素積累分子機(jī)制和改善果實(shí)品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

克隆紅肉火龍果細(xì)胞色素P450家族成員HpCYP76AD1基因全長(zhǎng)序列與甜菜BvCYP76AD1同屬于α類(lèi)，推測(cè)其在甜菜色素合成的兩個(gè)上游羥基化反應(yīng)中發(fā)揮重要功能。HpCYP76AD1基因在果實(shí)成熟期間大幅上調(diào)表達(dá)，參與果實(shí)成熟期間的甜菜紅素積累。