田津津，王鴻宇，孫娜，張哲，劉衛(wèi)賓，陳佳楠，計(jì)宏偉

（天津商業(yè)大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，天津 300134）

目前，真空冷凍干燥技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品、藥品及生物制品的保存。食品包括肉類、魚類及果蔬等，相比于傳統(tǒng)干燥技術(shù)，通過(guò)真空冷凍干燥技術(shù)凍干后的果蔬在外觀、顏色、抗氧化活性、植物化學(xué)成分及風(fēng)味等方面都有明顯的優(yōu)勢(shì)[1-4]。肉類和魚類方面的應(yīng)用[5-6]優(yōu)勢(shì)在其貨架壽命和食用價(jià)值[7]。在藥品方面的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)主要是針對(duì)一些熱敏性以及一些難溶或不溶于水的藥物，使其能夠更好地保留原有的微觀結(jié)構(gòu)，提高藥物穩(wěn)定性，延長(zhǎng)保存時(shí)間等[8]。但該技術(shù)面臨諸多的技術(shù)難題，如能耗大、效率低和樣品損傷等問(wèn)題。

在真空冷凍干燥過(guò)程中，塌陷溫度Tc與玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg′有著密切的關(guān)系，Tg′是凍干過(guò)程中最大的凍結(jié)濃縮液溫度。對(duì)于一些高要求的藥品，以Tg′作為凍干過(guò)程升華的臨界溫度時(shí)可防止凍結(jié)濃縮液塌陷破壞原有結(jié)構(gòu)。研究表明不同樣品測(cè)定的Tc與Tg′存在一定的差值。溫度高于Tg′時(shí)凍結(jié)基質(zhì)黏度降低，而塌陷溫度Tc通常比Tg′高出1 ℃～3 ℃[9]，因固體剛性不足以支撐多孔海綿干燥層質(zhì)量而發(fā)生結(jié)構(gòu)塌陷[10]。干燥升華過(guò)程中Tg′是重要的參考依據(jù)，溫度高于濃縮液的Tg′時(shí)黏度降低，當(dāng)黏度低于10 Pa·s 時(shí)，材料出現(xiàn)實(shí)質(zhì)性變化[11-12]，由于表面張力的存在使升華通道進(jìn)行合并，干燥層機(jī)械強(qiáng)度降低，出現(xiàn)塌陷現(xiàn)象[13-14]，且不同濃度的蔗糖作為保護(hù)蛋白質(zhì)的制劑凍干后會(huì)發(fā)生不同程度的塌陷[15]。左建國(guó)等[16]在對(duì)叔丁醇/蔗糖水三元溶液的研究中發(fā)現(xiàn)，Tc比對(duì)應(yīng)溶液的Tg′高出1.5 ℃。楊智等[17]研究果糖、蔗糖、海藻糖和氯化鈉水的二元溶液發(fā)現(xiàn)，Tc比對(duì)應(yīng)溶液的Tg′高5 ℃左右。

Tg′在生物低溫保存領(lǐng)域日益被重視[18]，真空冷凍干燥技術(shù)通過(guò)采用高的降溫速率和添加保護(hù)劑使溶液降溫至Tg′以下，細(xì)胞達(dá)到休眠狀態(tài)，為細(xì)胞營(yíng)造了玻璃態(tài)環(huán)境，減少了晶體的生成，避免晶體對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械損傷，提升了細(xì)胞存活率，延長(zhǎng)了物品保存時(shí)間[19-20]。樣品種類的不同或同一樣品的不同降溫、升溫速率均會(huì)對(duì)Tg′產(chǎn)生一定的影響，其中降溫速率對(duì)Tg′的影響較小[21]。Yazdi 等[22]測(cè)定發(fā)現(xiàn)升溫速率對(duì)Tg′能夠產(chǎn)生一定的影響，由于熱阻存在，升溫速率越大熱滯后越大，Tg′隨之上升。Knopp 等[23]研究蔗糖溶液的熱分析和凍干顯微圖中低溫轉(zhuǎn)變和高溫轉(zhuǎn)變的關(guān)系，通過(guò)與塌陷溫度作對(duì)比，確定低溫轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡЩD(zhuǎn)變溫度Tg′，高溫轉(zhuǎn)變?yōu)檠舆t溶解溫度。

國(guó)內(nèi)對(duì)于保護(hù)劑特性和凍干過(guò)程影響因素的研究較少，多數(shù)是通過(guò)Tg′來(lái)粗略地判定塌陷溫度Tc。由于對(duì)玻璃化轉(zhuǎn)變的研究不夠深入，常會(huì)混淆溶液的延遲溶解和玻璃化轉(zhuǎn)變過(guò)程。本文以凍干保護(hù)劑乳糖為研究對(duì)象，分析不同降溫速率下Tg′與Tc的相關(guān)性，為了解凍干保護(hù)劑特性和升華臨界溫度提供參考。

1 材料與儀器

1.1 試劑與材料

乳糖：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；液氮（純度＞99.99%）、氮?dú)猓兌龋?9.9%）：天津市永熙氣體有限公司；定性濾紙（孔徑15 μm～20 μm）：鄭州中天實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

差示掃描量熱儀（DSC Q-1000）、坩堝壓片機(jī)（TP-1）：美國(guó)TA 公司；電子天平（FA2204C）：上海越平科學(xué)儀器制造有限公司；冷干臺(tái)（Linkam FDSC196）：英國(guó)林克曼科學(xué)儀器公司；光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS BX-43）：日本奧林巴斯公司；真空泵（PFEIFFER D-35614）：德國(guó)普發(fā)技術(shù)有限公司；單道可調(diào)移液器（TopPeTTer）：北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；磁力攪拌器（LCDMS-ProN1）：上?？婆d儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液制備

試驗(yàn)所用溶液均按照質(zhì)量濃度配制，以10%乳糖/水二元溶液為例。稱取乳糖10.000 0 g，加入超純水定容至100 mL。

1.3.2 試驗(yàn)步驟

玻璃化轉(zhuǎn)化溫度測(cè)定：取12 μL 樣品溶液注入標(biāo)準(zhǔn)液體坩堝中，利用壓片機(jī)對(duì)坩堝密封處理。采用TA Universal Analysis 軟件分析熱流-溫度曲線中的過(guò)冷點(diǎn)、冰點(diǎn)、潛熱、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg′和冰的延遲溶解區(qū)間。

凍干過(guò)程觀察：在銀臺(tái)上涂一層導(dǎo)熱硅油，增強(qiáng)導(dǎo)熱效果。取2 μL 樣品溶液注射到載玻片上，用鑷子將載玻片放置在銀臺(tái)對(duì)應(yīng)位置，然后封閉其腔體。將樣品從室溫（23 ℃～28 ℃）以特定速率降溫至Tg′以下，保持5 min，然后將冷熱臺(tái)腔體抽真空至設(shè)定壓力（在升溫中保持），將凍結(jié)的樣品以一定的升溫速率升溫至20 ℃后，進(jìn)入脫水干燥階段。整個(gè)過(guò)程采用錄屏軟件和電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）相機(jī)拍攝相結(jié)合，確定圖片對(duì)應(yīng)的溫度變化，記錄樣品從凍結(jié)到干燥的整個(gè)過(guò)程。使用自帶的軟件對(duì)圖片進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 降溫速率對(duì)乳糖/水溶液凍結(jié)特性的影響

降溫速率對(duì)冰晶的形態(tài)、數(shù)量均有一定的影響。對(duì)于同一個(gè)樣品，當(dāng)降溫速率增大時(shí)，晶體的成核率隨之增大[21]，但冰晶生長(zhǎng)速率下降。

本研究以10%乳糖水二元溶液作為研究對(duì)象，冷凍過(guò)程的降溫速率分別設(shè)置為5、10、20、30、40 ℃/min將樣本從40 ℃降溫至-60 ℃，維持5 min 保證樣品充分凍結(jié)，然后以1 ℃/min 的升溫速率升至20 ℃，得到樣品的差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）曲線。通過(guò)放大升溫過(guò)程中的熱流-溫度曲線，分析轉(zhuǎn)變過(guò)程，并找到玻璃化轉(zhuǎn)變階段，確定玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。

10%乳糖溶液在不同降溫速率下的熱流-溫度曲線如圖1 所示。通過(guò)放大和分析熱流曲線可得到表1。

圖1 10%乳糖溶液不同降溫速率下的熱流-溫度曲線Fig.1 Heat flow-temperature curves at different cooling rates of 10% lactose solution

表1 降溫速率對(duì)過(guò)冷度的影響Table 1 The effect of cooling rate on the degree of subcooling

由表1 可以看出，降溫速率在30 ℃/min 時(shí)過(guò)冷度最低。當(dāng)降溫速率小于30 ℃/min 時(shí)，過(guò)冷度隨著降溫速率的增大而減小，則表明晶核的成核率降低。降溫速率大于30 ℃/min 時(shí)，過(guò)冷度隨著降溫速率的增大而增大，晶核成核率增大但是晶體小而密集。

在凍結(jié)樣品升溫過(guò)程中分析得到低溫和高溫轉(zhuǎn)變的溫度區(qū)間，低溫轉(zhuǎn)變溫度區(qū)間為-55 ℃～-38 ℃、高溫轉(zhuǎn)變溫度區(qū)間為-35 ℃～-20 ℃，低溫轉(zhuǎn)變溫度區(qū)間為玻璃化轉(zhuǎn)變過(guò)程。

圖2 為10%乳糖溶液在不同凍結(jié)速率情況下的DSC 匯總曲線。

圖2 10%乳糖溶液不同凍結(jié)速率的DSC 匯總曲線Fig.2 DSC summary curve of different freezing rates of 10% lactose solution

由圖2 可知，5 ℃/min～40 ℃/min 凍結(jié)時(shí)的熱流曲線變化趨勢(shì)相同，兩轉(zhuǎn)變區(qū)間基本保持不變，表明降溫速率對(duì)玻璃化轉(zhuǎn)變和凍結(jié)物的延遲溶解過(guò)程影響較小，間接證明了玻璃態(tài)的形成主要受到樣品本身的特性影響[21]；由于未發(fā)現(xiàn)明顯的反玻璃化現(xiàn)象，表明降溫速率對(duì)反玻璃化影響較小。圖3 為凍結(jié)速率對(duì)10%乳糖溶液轉(zhuǎn)變的影響。

圖3 凍結(jié)速率對(duì)10%乳糖溶液轉(zhuǎn)變的影響Fig.3 The effect of freezing rates on the transformation of 10% lactose solution

由圖3 可知，30 ℃/min 和40 ℃/min 的降溫曲線中，發(fā)現(xiàn)低溫轉(zhuǎn)變后熱流出現(xiàn)微弱反玻璃化趨勢(shì)，可能是由于降溫速率過(guò)高導(dǎo)致結(jié)晶不充分，從而升溫過(guò)程出現(xiàn)重結(jié)晶。

由圖3 可知，10%乳糖溶液在5 ℃/min～20 ℃/min 凍結(jié)速率條件下，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg′波動(dòng)較小，10 ℃/min時(shí)最低，不同降溫速率時(shí)，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg′基本保持不變，與文獻(xiàn)[24]中的蔗糖溶液測(cè)試過(guò)程得到的結(jié)果相吻合。高于20 ℃/min 時(shí)，低溫轉(zhuǎn)變溫度呈下降趨勢(shì)，且降溫速率每高出10 ℃/min 時(shí)，Tg′降低1 ℃左右。5 ℃/min～30 ℃/min 速率降溫時(shí)，10 ℃/min 時(shí)Tg′最低，結(jié)合表1 過(guò)冷度表述，降溫速率小于30 ℃/min 時(shí)過(guò)冷度隨著降溫速率的增大而減小，且晶核的成核率降低，表明10 ℃/min 降溫時(shí)未凍水含量較大，玻璃化轉(zhuǎn)變程度較大，根據(jù)增塑作用，得出Tg′最低。

2.2 降溫速率對(duì)乳糖/水溶液凍干過(guò)程的影響

將10%乳糖溶液樣品從室溫（23 ℃～28 ℃）分別以5、10、20、30、40 ℃/min 降溫至-50 ℃，維持5 min 保證充分凍結(jié)，將冷熱臺(tái)腔體壓力調(diào)至10 Pa，然后以1 ℃/min 升溫干燥時(shí)，樣品塌陷狀況如圖4 所示。

圖4 10%乳糖溶液的不同降溫速率的凍干顯微圖Fig.4 Freeze-drying micrograph of a 10% lactose solution at different cooling rates

由圖4 可知，對(duì)比凍結(jié)過(guò)程的圖片無(wú)明顯變化。且40 ℃/min 降溫時(shí)的Tg′低于10 ℃/min 降溫時(shí)的Tg′，結(jié)合表1 數(shù)據(jù)可知降溫速率由30 ℃/min 增大至40 ℃/min時(shí)，過(guò)冷度變大，故成核率增大，不利于晶體生長(zhǎng)，可見40 ℃/min 時(shí)的玻璃化程度更高。

分析干燥過(guò)程發(fā)現(xiàn)20 ℃/min 凍結(jié)時(shí)的干燥效果相對(duì)較好，塌陷和裂化現(xiàn)象都比較微弱；30 ℃/min 凍結(jié)時(shí)的凍干顯微圖未觀察到塌陷，但裂化現(xiàn)象比20 ℃/min降溫時(shí)嚴(yán)重，更好地證明了表1 結(jié)論中30 ℃/min 時(shí)過(guò)冷度最小、成核率低、晶體形態(tài)相對(duì)較大的結(jié)果，更有利于一次干燥過(guò)程中水分的升華，避免塌陷出現(xiàn)。對(duì)比圖4A 組和圖4B 組得出，降溫速率為10 ℃/min 時(shí)塌陷現(xiàn)象較嚴(yán)重，表明10 ℃/min 降溫時(shí)，玻璃化轉(zhuǎn)變程度更高，也表明過(guò)冷度低時(shí)成核率低，而玻璃態(tài)占比高；對(duì)比圖4B 組和圖4C 組，證明了表1 結(jié)論中20 ℃/min凍結(jié)時(shí)冰晶形態(tài)大于10 ℃/min 降溫時(shí)的研究結(jié)果，有利于水分升華，且玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg′大；對(duì)比圖4D 組和圖4E 組，發(fā)現(xiàn)40 ℃/min 塌陷現(xiàn)象更嚴(yán)重，證明降溫速率大于30 ℃/min 時(shí)，形成的冰晶成核率較大，但是冰晶形態(tài)小，不利于水分的升華，導(dǎo)致較早出現(xiàn)塌陷現(xiàn)象，隨著溫度升高塌陷越嚴(yán)重。

圖5 為不同降溫速率條件下的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg′、塌陷溫度Tc和高溫轉(zhuǎn)變溫度THg的影響。

圖5 不同降溫速率對(duì)塌陷溫度的影響Fig.5 The influence of different cooling rates on collapse temperature

由圖5 可知，Tc在Tg′和THg之間，再次確定低溫轉(zhuǎn)變是玻璃化轉(zhuǎn)變過(guò)程。在5 ℃/min～40 ℃/min 降溫過(guò)程中，30 ℃/min 降溫時(shí)Tc與Tg′溫差最大，40 ℃/min 降溫時(shí)差值最小，表明在乳糖30 ℃/min 凍結(jié)時(shí)更有利于水分升華，在40 ℃/min 時(shí)玻璃化轉(zhuǎn)變程度最高，在升溫過(guò)程中會(huì)較早出現(xiàn)黏性流動(dòng)產(chǎn)生的塌陷。

3 結(jié)論

本文通過(guò)差示掃描量熱法研究了不同降溫速率下乳糖/水二元溶液的坍塌現(xiàn)象和熱歷史的性質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)：10%乳糖溶液在5 ℃/min～40 ℃/min 降溫速率下對(duì)Tg′波動(dòng)影響較小，過(guò)冷度隨著降溫速率呈V 型趨勢(shì)，且在30 ℃/min 降溫時(shí)過(guò)冷度最低，樣品的結(jié)晶成核率最低，Tg′在5 ℃/min～20 ℃/min 降溫時(shí)呈V 型趨勢(shì)，10 ℃/min 最低，高于20 ℃/min 時(shí)Tg′呈下降趨勢(shì)，且每高出10 ℃/min 時(shí)Tg′約降低1 ℃，降溫速率對(duì)玻璃態(tài)的形成影響較小。乳糖/水二元溶液在凍干過(guò)程中，通過(guò)研究可知在20 ℃/min 和30 ℃/min 降溫過(guò)程中干燥效果最好，僅出現(xiàn)裂化現(xiàn)象，其他降溫速率條件下均有塌陷出現(xiàn)，表明在降溫過(guò)程中溶液的成核率降低，但冰晶生成形態(tài)相對(duì)較大，可以有效促進(jìn)水分升華。