竇 環(huán)， 喬曉月， 傅娟華， 王婷婷， 侯亞義， 沈蘇南

(南京大學(xué) a.醫(yī)學(xué)院； b.生命科學(xué)學(xué)院， 南京 210023)

0 引 言

拔尖創(chuàng)新能力的培養(yǎng)有助于新醫(yī)科人才成功面對未來醫(yī)學(xué)的挑戰(zhàn)，提高我國在醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域的核心競爭力。免疫學(xué)作為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的前沿學(xué)科，在臨床醫(yī)學(xué)、重大疾病的預(yù)防與治療、生物制藥等領(lǐng)域發(fā)揮了越來越重要的作用。自主研究型教學(xué)將有利于免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)發(fā)揮其對于新醫(yī)學(xué)專業(yè)人才綜合能力和創(chuàng)新能力培養(yǎng)的關(guān)鍵性作用。我校醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室在推進(jìn)自主研究型免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的過程中，圍繞總體教學(xué)目標(biāo)，在夯實(shí)免疫學(xué)基本理論和基本實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上，引導(dǎo)學(xué)生發(fā)現(xiàn)未知答案的新問題，學(xué)生在強(qiáng)烈學(xué)習(xí)動(dòng)機(jī)的支配下，制定明確的研究目標(biāo)和研究計(jì)劃，采用前沿性的免疫學(xué)檢測分析方法，創(chuàng)新性地完成實(shí)驗(yàn)過程。學(xué)生在完成此類型實(shí)驗(yàn)的過程中，大大提升了免疫學(xué)研究的科學(xué)素養(yǎng)，而不僅僅滿足于知識(shí)點(diǎn)的學(xué)習(xí)。

一般認(rèn)為，在腫瘤、慢性炎癥、創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下，固有免疫系統(tǒng)出現(xiàn)了一群未成熟的髓系細(xì)胞：髓源抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)，包括髓系祖細(xì)胞、不成熟的巨噬細(xì)胞、不成熟的粒細(xì)胞以及不成熟的樹突狀細(xì)胞等[1]。通常，MDSCs 細(xì)胞主要分為兩大類：粒細(xì)胞樣 MDSC(granulocytic MDSC，G-MDSC)和單核細(xì)胞樣 MDSC(monocytic MDSC，M-MDSC)；G-MDSC 在表型和形態(tài)上與中性粒細(xì)胞相似，而 M-MDSC 與單核細(xì)胞更相似，并且利用不同的功能分子抑制免疫反應(yīng)。在多種腫瘤患者的組織中，MDSCs 明顯增加且可通過直接或間接方式抑制 T 細(xì)胞的免疫活性，進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸[2]。近年研究顯示，MDSCs 及其亞群具有一些新的生物學(xué)功能：MDSCs可作為破骨細(xì)胞祖細(xì)胞，在骨髓微環(huán)境的 IL-6、IL-11 和 RANKL 細(xì)胞因子作用下向成骨細(xì)胞分化；在腫瘤微環(huán)境內(nèi)，M-MDSC 可直接破壞腫瘤相關(guān)抗原特異的 T 細(xì)胞活化反應(yīng)；臨床肝衰竭病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，M-MDSC 具有較弱的細(xì)菌吞噬能力等。在以往的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中，上述學(xué)科進(jìn)展僅停留在知識(shí)點(diǎn)層面，對MDSCs的免疫學(xué)特性無法通過實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行深入學(xué)習(xí)。

我院免疫學(xué)教研室嘗試推進(jìn)自主研究型免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，如何有效地開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)教學(xué)一直是工作的重點(diǎn)。近期，同學(xué)們分別對兩批周齡相同的雌性C57BL/6小鼠進(jìn)行側(cè)腦室生理鹽水注射手術(shù)，發(fā)現(xiàn)除了一批小鼠術(shù)后恢復(fù)良好外，另一批小鼠出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)損傷現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為：小鼠身體呈屈曲狀，有向左側(cè)或右側(cè)傾斜、旋轉(zhuǎn)以及連續(xù)轉(zhuǎn)圈的行為，甚至引發(fā)小鼠死亡。指導(dǎo)教師立即引導(dǎo)同學(xué)們分析原因，復(fù)盤實(shí)驗(yàn)過程，同學(xué)們推測這可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售公司在出售前，分別給兩批小鼠喂食了維持飼料和繁育飼料這兩種不同的飼料有關(guān)?；诖舜谓虒W(xué)實(shí)踐中的偶然發(fā)現(xiàn)，在病原體鑒定與免疫細(xì)胞分析技術(shù)教學(xué)中，以學(xué)生為中心，突出流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)這一抓手，開展了“繁殖飼料對腦室注射小鼠髓系細(xì)胞免疫功能影響評價(jià)”的探索，詳細(xì)分析腦室注射小鼠MDSCs及其亞群的比例與功能在維持飼料飲食組和繁殖飼料飲食組之間的差異。本文以此教學(xué)實(shí)踐為例，對自主研究型實(shí)驗(yàn)教改經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行了總結(jié)，以期為培養(yǎng)拔尖創(chuàng)新型新醫(yī)科人才做好準(zhǔn)備。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料

無特定病原體(Specific pathogen free, SPF)級雌性C57BL/6小鼠，6～8周齡，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[SCXK(蘇)2016-0010]，飼養(yǎng)于SPF級屏障系統(tǒng)中，室溫22～24 ℃，室內(nèi)相對濕度40%～70%，保持室內(nèi)12 h進(jìn)行燈的明暗自動(dòng)切換，小鼠可以自由進(jìn)行水和食物的攝取。維持飼料及繁殖飼料均委托江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司制作。

2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

紅細(xì)胞裂解液、Fc受體阻斷劑(Miltenyi Biotec，貨號(hào)：130-092-575)、抗鼠CD45-APC(Biolegend，貨號(hào)：103112)、抗鼠CD11b-FITC(BD Pharmingen，貨號(hào)：553310)、抗鼠Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)-Alexa Flour 647(Biolegend，貨號(hào)：108418)、抗鼠Ly6c-PE(Biolegend，貨號(hào)：128008)、抗鼠CD3-Alexa Flour 532(Miltenyi Biotec，貨號(hào)：130-109-836)、抗鼠CD4-PE Cy5.5(Biolegend，貨號(hào)：100410)、抗鼠CD8-APC Cy7(Biolegend，貨號(hào)：100714)均購自南京福麥斯生物技術(shù)有限公司。

GentleMACS全自動(dòng)組織處理器(Miltenyi Biotec)、全光譜流式細(xì)胞儀(Cytek)由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)中心提供。

3 實(shí)驗(yàn)步驟

基于教學(xué)實(shí)踐中的偶然發(fā)現(xiàn)，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹莆樟魇郊?xì)胞術(shù)原理及方法，引導(dǎo)學(xué)生自主查閱文獻(xiàn)，經(jīng)課堂討論與任課教師商議后，最終擬定具體步驟。實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

圖1 繁殖飼料對腦室注射小鼠MDSCs免疫功能影響評價(jià)實(shí)驗(yàn)流程

4 FCM檢測方法的建立

4.1 單細(xì)胞懸液的制備

以脾臟細(xì)胞為例，獲取小鼠脾臟組織，取大小約1/4組織塊放入GentleMACS分離管C管中，加PBS 5 mL，選擇小鼠脾臟裂解程序，研磨組織塊2次；組織勻漿以濾網(wǎng)過濾去除殘?jiān)?，收集至離心管中，再用PBS沖洗C管，殘液經(jīng)過濾網(wǎng)收集至離心管中，4 ℃，300 g離心5 min，棄上清；加入1 mL 紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，室溫下裂解紅細(xì)胞1 min，5 mL PBS終止裂解，4 ℃，300 g離心5 min，棄上清；1 mL PBS洗兩次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，備用。

4.2 流式抗體染色

將制備好單細(xì)胞懸液分裝各流式管中(每管不少于1×106個(gè)細(xì)胞)，于各樣品管中加入FC-blocker稀釋液，室溫下封閉10 min；加入10 μL流式抗體稀釋液混勻，注意做好陰性對照、同型抗體對照、單標(biāo)抗體對照、FMO對照等處理，4 ℃避光孵育30 min，500 μL PBS洗滌兩次，加100 μL PBS混勻，進(jìn)行流式檢測。

4.3 流式細(xì)胞術(shù)圈門策略

以小鼠外周血MDSCs的圈門策略為例，學(xué)生們通過參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-4]，先依據(jù)FSC-A/SSC-A散點(diǎn)圖排除細(xì)胞碎片并圈出細(xì)胞(一級門)，然后在SSC-H/SSC-A散點(diǎn)圖中去除粘連細(xì)胞(二級門)并圈出單個(gè)細(xì)胞，接著在CD11b-FITC/Gr-1-AF647細(xì)胞群散點(diǎn)圖中選定 CD11b+Gr-1+細(xì)胞群為 MDSCs(三級門)，在CD11b-FITC/SSC-A細(xì)胞群散點(diǎn)圖中選定CD11b+細(xì)胞群(三級門)，最后在Gr-1-AF647/Ly6c-PE細(xì)胞群散點(diǎn)圖中選定CD11b+Gr-1+Ly6Clo細(xì)胞群為G-MDSC(四級門)、選定CD11b+Gr-1-Ly6Chi細(xì)胞群為M-MDSC(四級門)，詳見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀分析MDSCs的圈門策略

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

5.1 繁殖飼料對腦室注射小鼠MDSCs及其亞群細(xì)胞比例的影響

通過FCM技術(shù)檢測各組小鼠骨髓樣本后，學(xué)生們發(fā)現(xiàn)：術(shù)后第1天，與維持飼料組相比，繁殖飼料組骨髓中總的MDSCs比例無明顯變化，G-MDSCs細(xì)胞比例減少，M-MDSCs比例增多；術(shù)后3或5天，繁殖飼料組小鼠骨髓總的MDSCs比例與G-MDSCS變化一致，均表現(xiàn)為增加，而M-MDSCs比例減少[見圖3(a)]。小鼠脾臟樣本結(jié)果顯示：與維持飼料組相比，繁殖飼料組小鼠在術(shù)后1～5天內(nèi)，脾臟總MDSCs和G-MDSCs的比例一直呈現(xiàn)明顯增加現(xiàn)象，而M-MDSCs的比例出現(xiàn)相反的變化趨勢[見圖3(b)]。

5.2 繁殖飼料對腦室注射小鼠外周T細(xì)胞及其亞群比例的影響

學(xué)生通過查閱文獻(xiàn)，了解到MDSCs常在晚期癌癥患者體內(nèi)出現(xiàn)[5-6]，被認(rèn)為是先天性和適應(yīng)性免疫的有效抑制劑，可以抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化[7-8]。因此，指導(dǎo)老師建議學(xué)生繼續(xù)分析兩組小鼠的T細(xì)胞及其亞群細(xì)胞比例。通過FCM技術(shù)檢測各組小鼠外周血樣本，學(xué)生還發(fā)現(xiàn)：與維持飼料組相比，術(shù)后1～3天，小鼠外周血的CD3+總T細(xì)胞、CD4+以及CD8+T細(xì)胞比例均無明顯改變；術(shù)后5天，CD3+T細(xì)胞比例仍無明顯變化，但CD4+T細(xì)胞比例顯著減少，CD8+T細(xì)胞比例明顯增加[見圖4(a)]。小鼠脾臟的結(jié)果也顯示：與維持飼料組相比，術(shù)后1～5天，小鼠脾臟CD3+總T細(xì)胞、CD4+和CD8+T細(xì)胞的比例均明細(xì)增加[見圖4(b)]。結(jié)合MDSCs及其亞型比例的變化，因此，可以推測，在不同飼料條件下，M-MDSCs可能產(chǎn)生抑制T細(xì)胞的作用。

圖4 小鼠外周血和脾臟內(nèi)T淋巴細(xì)胞的變化

5.3 繁殖飼料對腦室注射小鼠腦免疫細(xì)胞的影響

炎癥介質(zhì)會(huì)損害未成熟的骨髓細(xì)胞通過MDSCs向巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞的分化。當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，位于骨髓和外周淋巴器官中的MDSCs通過趨化性遷移到發(fā)炎的組織中，發(fā)揮其免疫抑制功能，預(yù)防組織損傷，但同時(shí)也干擾組織中免疫穩(wěn)態(tài)的維持，例如抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞的功能[9]。因此，在上述實(shí)驗(yàn)探索的基礎(chǔ)上，指導(dǎo)教師建議學(xué)生也繼續(xù)對腦中免疫細(xì)胞改變進(jìn)行分析。通過FCM技術(shù)檢測，學(xué)生發(fā)現(xiàn)：與維持飼料組相比，術(shù)后1～5天內(nèi)，繁殖飼料組小鼠海馬和皮層中的小膠質(zhì)細(xì)胞比例持續(xù)減少，浸潤的巨噬細(xì)胞比例持續(xù)增加；但是，淋巴細(xì)胞先術(shù)后在第1～3天內(nèi)減少、第5天時(shí)增加(見圖5)。

6 討論與總結(jié)

病原體鑒定與免疫細(xì)胞分析技術(shù)實(shí)驗(yàn)課程是我院免疫學(xué)學(xué)科體系中重要的組成部分，主要介紹了醫(yī)學(xué)微生物、寄生蟲等病原體的基本特征及分離鑒定方法、各類免疫細(xì)胞基本功能以及臨床上常用的免疫檢測技術(shù)。通過基礎(chǔ)型、綜合型實(shí)驗(yàn)教學(xué)的努力，實(shí)現(xiàn)了臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生在病原微生物和免疫學(xué)理論知識(shí)上的拓展和實(shí)踐[10-12]。因此，在培養(yǎng)高層次醫(yī)學(xué)拔尖創(chuàng)新人才目標(biāo)指導(dǎo)下，如何對該實(shí)驗(yàn)課程進(jìn)行教學(xué)改革，這是免疫學(xué)教研室一直以來關(guān)注的焦點(diǎn)。自主研究型實(shí)驗(yàn)，不僅可以加深學(xué)生對理論知識(shí)的理解，而且通過自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施相關(guān)操作，更加有助于提高他們動(dòng)手操作、獨(dú)立思考和靈活調(diào)用理論知識(shí)來發(fā)現(xiàn)問題、分析問題并解決問題的綜合能力。高校實(shí)驗(yàn)教學(xué)同行們也在根據(jù)自身教學(xué)資源以及施教學(xué)生的素質(zhì)情況，進(jìn)行不斷教學(xué)探索和創(chuàng)新。劉亞豐等將虛擬仿真技術(shù)運(yùn)用于生物技術(shù)自主研究型實(shí)驗(yàn)，彌補(bǔ)生物大分子分離純化實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的不足[13]。吾爾恩·阿合別爾迪等利用新疆伊犁河谷特色微生物資源，融入微生物學(xué)研究型實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革，取得了積極的教學(xué)效果[14]。FCM是一種綜合了激光技術(shù)、電子物理、光電測量、流體力學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及細(xì)胞熒光化學(xué)、單克隆抗體等各學(xué)科的知識(shí)為一體的新型分析技術(shù)[15]。以流式細(xì)胞術(shù)為抓手開展的自主研究型實(shí)驗(yàn)，能夠幫助學(xué)生掌握FCM的基本原理及應(yīng)用領(lǐng)域，培養(yǎng)流式細(xì)胞儀獨(dú)立操作技能，與免疫學(xué)研究的前沿進(jìn)展相結(jié)合，促成了學(xué)生創(chuàng)新和科研實(shí)踐能力的提高。

基于免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的偶然發(fā)現(xiàn)，嘗試以流式細(xì)胞術(shù)為抓手開展自主研究型實(shí)驗(yàn)教學(xué)，引導(dǎo)學(xué)生根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖灾鞑殚單墨I(xiàn)、總結(jié)實(shí)驗(yàn)方案，經(jīng)過課堂討論環(huán)節(jié)擬定具體流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方案，以學(xué)生為主體實(shí)施實(shí)驗(yàn)檢測過程，最終學(xué)生們通過詳細(xì)分析小鼠MDSCs及其亞群、T細(xì)胞以及腦內(nèi)免疫細(xì)胞的比例，評價(jià)了腦室注射小鼠在維持飼料組和繁殖飼料組之間的MDSCs細(xì)胞的免疫功能差異，這極大地提高了學(xué)生學(xué)習(xí)的自主性和實(shí)踐性。同學(xué)們通過自主研究型免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的實(shí)踐，初步發(fā)現(xiàn)小鼠6～8周前喂食繁育飼料和維持飼料等兩種不同的飼料，將對腦室注射手術(shù)的小鼠產(chǎn)生影響，如外周血、脾臟、骨髓甚至腦中主要免疫細(xì)胞的比例以及免疫功能出現(xiàn)顯著差異，提示實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)過程中需要確保實(shí)驗(yàn)小鼠喂食正確，否則會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成不良影響。此外，本教學(xué)實(shí)踐還存在不足，對于造成維持飼料組和繁殖飼料組的腦室注射手術(shù)小鼠免疫細(xì)胞數(shù)量產(chǎn)生差異的原因尚不能最終確認(rèn)，還有待進(jìn)一步探究。學(xué)生還通過分析飼料營養(yǎng)成分，發(fā)現(xiàn)這兩種飼料的差別主要在于繁殖飼料中賴氨酸、蛋氨酸和胱氨酸的含量高于維持飼料，接著他們通過查閱氨基酸代謝與抗腫瘤研究領(lǐng)域的文獻(xiàn)，驚喜地發(fā)現(xiàn)，恰恰有報(bào)道指出胱氨酸能夠抑制MDSCs 的活性，進(jìn)而減少免疫抑制的發(fā)生[16]。然而，在腦室注射小鼠中未有這3種氨基酸與MDSCs相互作用的相關(guān)報(bào)道。大家一致認(rèn)為，本實(shí)驗(yàn)教學(xué)發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)繁殖飼料的腦室注射小鼠骨髓和脾臟中MDSCs數(shù)量與正常組相比有顯著變化，可能為氨基酸代謝與MDSCs的相關(guān)性研究初步提供依據(jù)，也為進(jìn)一步提高學(xué)生科學(xué)研究能力解決相關(guān)科學(xué)問題打好了扎實(shí)的理論和實(shí)踐的基礎(chǔ)。

綜上所述，在病原體鑒定與免疫細(xì)胞分析技術(shù)教學(xué)中運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)推進(jìn)自主研究型免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的經(jīng)歷十分寶貴，為其他醫(yī)學(xué)院校的相關(guān)課程改革提供了一定的參考，也為國家培養(yǎng)拔尖創(chuàng)新型新醫(yī)科人才貢獻(xiàn)了力量。