孫雪騏，黃麒睿，孫彥珍，王 建

前列腺癌的發(fā)病率位居男性惡性腫瘤前列，是與腫瘤死亡相關(guān)的主要原因之一[1]。目前，我國前列腺癌的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢[2]。根治性前列腺切除術(shù)和放療是治療前列腺癌的重要手段。然而，高危性前列腺癌患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移限制了放療的效果[3]。即使有充足的氧氣，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞更依賴糖酵解產(chǎn)生大量乳酸，這種有氧糖酵解被稱為Warburg效應(yīng)[4-5]。目前，已經(jīng)有研究確定Warburg效應(yīng)在實(shí)體瘤發(fā)生中的作用及其與不良預(yù)后的相關(guān)性，而Warburg效應(yīng)在前列腺癌中的研究尚不足。前列腺特異性抗原(prostate specific antigen, PSA)是唯一被廣泛使用的前列腺癌生物學(xué)標(biāo)志物[6]；但PSA有局限性，其作為診斷前列腺癌的標(biāo)志物有較高的誤診率[7]。己糖激酶(hexokinase, HK)是糖酵解的第一個限速酶，HKⅡ過表達(dá)是腫瘤發(fā)生的必要條件，其不僅能增加糖酵解的速度，同時也是一種新型的前列腺生物學(xué)標(biāo)志物[8]。基于為患者預(yù)后提供更好的風(fēng)險分層，2014年國際泌尿病理協(xié)會(ISUP)專家共識會議進(jìn)一步修訂了前列腺癌的Gleason分級系統(tǒng)[9]，提出了前列腺癌的等級分組系統(tǒng)，該系統(tǒng)由5個等級組成。學(xué)者們根據(jù)危險程度將前列腺癌分為低級別前列腺癌(Gleason分級分組1和2)和高級別前列腺癌(Gleason分級分組3、4、5)[10-11]。本文通過分析HKⅡ和PSA在前列腺癌不同分級分組中的表達(dá)水平以及兩者的相關(guān)性及臨床意義，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年10月～2021年3月贛州市人民醫(yī)院病理科存檔的前列腺標(biāo)本224例，包括35例正常前列腺對照組織和189例前列腺癌組織標(biāo)本。189例前列腺癌標(biāo)本選取未接受過術(shù)前放、化療或激素藥物治療，且術(shù)后病理檢查均證實(shí)為前列腺癌?；颊吣挲g54～90歲，平均70歲。前列腺癌Gleason分級分組：低級別前列腺癌93例，高級別前列腺癌96例。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)江西省贛州市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚切片，HE染色。免疫組化染色采用EnVision兩步法，行高溫抗原修復(fù)，DAB顯色，顯微鏡下觀察。一抗為HKⅡ抗體(Abcam公司)和PSA(福州邁新公司)，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，并設(shè)陽性和陰性對照。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)染色結(jié)果用免疫反應(yīng)積分(immunoreactive score, IRS)評價，IRS=陽性細(xì)胞百分比×染色強(qiáng)度。(1)根據(jù)陽性細(xì)胞所占腫瘤細(xì)胞的百分比計分：陽性細(xì)胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分；(2)根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度計分：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕色為3分。以IRS≥4分為高表達(dá)，<4分為低表達(dá)。觀察時隨機(jī)選取10個高倍視野，結(jié)果取平均值。染色結(jié)果綜合兩位臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師的判斷。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。HKⅡ、PSA在各前列腺組織間的表達(dá)差異采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，通過χ2檢驗(yàn)分析HKⅡ、PSA表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常前列腺組織及不同分級前列腺癌中HKⅡ的表達(dá)HKⅡ蛋白表達(dá)定位在線粒體外膜、細(xì)胞質(zhì)(圖1)，呈棕褐色。在35例正常前列腺組織中，HKⅡ高表達(dá)率為14.3%；189例前列腺癌組織中HKⅡ高表達(dá)率為63.5%，其中低級別與高級別前列腺癌組織中的高表達(dá)率分別為52.7%和74.0%。結(jié)果顯示，從正常前列腺組織到前列腺癌的過程中，隨著前列腺癌的進(jìn)展，HKⅡ高表達(dá)率逐漸增加，且HKⅡ在不同級別前列腺癌的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1)。前列腺癌中HKⅡ蛋白表達(dá)與Gleason評分、組織學(xué)分級及分期的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)，而與前列腺癌患者年齡、血清總PSA水平無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

圖1 A.正常前列腺組織中HKⅡ低表達(dá)，EnVision兩步法；B.低級別前列腺癌中HKⅡ低表達(dá)，EnVision兩步法；C.高級別前列腺癌中HKⅡ高表達(dá)，EnVision兩步法 圖2 A.正常前列腺組織中PSA低表達(dá)，EnVision兩步法；B.低級別前列腺癌中PSA高表達(dá)，EnVision兩步法；C.高級別前列腺癌中PSA高表達(dá)，EnVision兩步法

2.2 正常前列腺組織及不同分級前列腺癌中PSA的表達(dá)PSA蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)(圖2)，呈棕褐色。在35例正常前列腺組織中，PSA高表達(dá)率為37.1%；在前列腺癌組織中，PSA高表達(dá)率為96.3%，明顯高于正常前列腺組織(P<0.01)，但PSA蛋白在低級別與高級別前列腺癌組織中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。PSA蛋白高表達(dá)與血清總PSA表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)，這更加證實(shí)前列腺癌組織中PSA蛋白與血清總PSA存在相關(guān)性。

表1 正常前列腺組織和不同級別前列腺癌組織中HKⅡ和PSA的表達(dá)

表2 前列腺癌中HKⅡ和PSA蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 前列腺癌中HKⅡ和PSA表達(dá)的相關(guān)性正常前列腺組織中，HKⅡ和PSA均低表達(dá)為54.3%(19/35)，均高表達(dá)僅5.7%(2/35)，提示在正常前列腺組織中PSA結(jié)合HKⅡ運(yùn)用有助于區(qū)分前列腺病變組織。在前列腺癌組織中，HKⅡ和PSA均高表達(dá)為63.0%(119/189，P<0.05，表3)，表明在前列腺癌中HKⅡ和PSA的表達(dá)有一定相關(guān)性。與正常前列腺組織相比，前列腺癌中HKⅡ和PSA的高表達(dá)率明顯升高(P<0.05)，但隨著前列腺癌的進(jìn)展，低級別與高級別前列腺癌中HKⅡ和PSA均高表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 前列腺組織中HKⅡ與PSA表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

目前，前列腺癌的發(fā)病率位居男性惡性腫瘤的前列。臨床上運(yùn)用前列腺活檢來診斷前列腺癌，尚缺乏簡單、準(zhǔn)確的指標(biāo)來監(jiān)測和評估前列腺癌的預(yù)后以及確診后的個體化治療。血清PSA檢查和組織學(xué)標(biāo)本Gleason分級系統(tǒng)是較為常用的預(yù)后因素，然而它們通常無法準(zhǔn)確預(yù)測疾病的進(jìn)展。為最大限度地提高前列腺癌診斷的特異性和敏感性，隨著基因組和蛋白質(zhì)組技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)一些替代生物學(xué)標(biāo)志物以便更好的區(qū)別高危腫瘤。

Warburg效應(yīng)是腫瘤存活和生長的標(biāo)志。大多數(shù)癌細(xì)胞有過量的糖酵解通量，為其增殖和生長提供能量，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[12]。HKⅡ是一種絲氨酸蛋白酶，79%的氨基酸序列與PSA相同，主要在前列腺中產(chǎn)生，以酶原的形式在體內(nèi)分泌，在細(xì)胞外作為活性酶被激活[13]。HKⅡ是腫瘤細(xì)胞中葡萄糖代謝最重要的亞型，在惡性腫瘤中顯著上調(diào)[14]，HKⅡ異常表達(dá)與多種腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，其過表達(dá)不僅提高了糖酵解的速率，而且也是腫瘤發(fā)生所必要的[15-16]。HKⅡ在腫瘤細(xì)胞中具有促進(jìn)增殖和抗凋亡的雙重特性[17]。大量研究證實(shí)，血清HKⅡ有助于前列腺癌的檢測和預(yù)后[13]，在一些研究中，它甚至比血清PSA更能預(yù)測前列腺癌的進(jìn)展[18]。

本實(shí)驗(yàn)顯示與正常前列腺組織相比，HKⅡ在前列腺癌中的表達(dá)顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)Warburg效應(yīng)的代謝重編程在前列腺癌中有推動作用。有文獻(xiàn)報道行單變量Cox回歸分析顯示：臨床分期和Gleason評分與腫瘤復(fù)發(fā)緊密相關(guān)[19]。此外，前列腺切除術(shù)后HKⅡ的升高是否比術(shù)前更好地預(yù)測復(fù)發(fā)也需要評估[20]。前列腺癌分化程度和Warburg效應(yīng)在致癌過程中的作用尚不清楚，尋找有效的生物標(biāo)志物在預(yù)測前列腺癌進(jìn)展和預(yù)后方面具有不可或缺的作用。本組發(fā)現(xiàn)：HKⅡ在低級別和高級別前列腺癌中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示HKⅡ可能對腫瘤分化有重要的臨床價值，HKⅡ可能是高危前列腺腫瘤的良好標(biāo)志物。

文獻(xiàn)報道PSA血清檢測對PSA水平4～10 ng/mL之間的陽性預(yù)測值為25%～35%，對PSA水平>10 ng/mL的陽性預(yù)測值為50%～80%[21]。研究表明，前列腺癌分級越高血清PSA越高，提示PSA在鑒別高風(fēng)險前列腺癌中有臨床參考價值[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：與正常前列腺組織相比，PSA蛋白在前列腺癌的表達(dá)顯著增加，但這種差異沒有體現(xiàn)在不同級別前列腺癌中。

有研究顯示，聯(lián)合檢測PSA、PCA3和HKⅡ可顯著提高前列腺癌早期診斷的敏感性和特異性，尤其是對有明顯骨轉(zhuǎn)移的患者[13]?；谶@些結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)假設(shè)HKⅡ和PSA表達(dá)之間存在相互作用，應(yīng)用免疫組化在蛋白水平的相關(guān)性分析中驗(yàn)證了該結(jié)果，提示根據(jù)前列腺癌患者的疾病進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)情況，推斷HKⅡ、PSA聯(lián)合檢測可提高前列腺癌的診斷準(zhǔn)確性，減少PSA篩查假陽性率高、過度護(hù)理，給患者帶來經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

綜上，HKⅡ和PSA在前列腺癌中高表達(dá)，且HKⅡ在不同級別前列腺癌中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示HKⅡ和前列腺癌的分化程度有關(guān)。由于抗體特異性和表位識別、基質(zhì)效應(yīng)以及與其它分子形成復(fù)合物等原因，PSA在免疫組化中得到的結(jié)果與HKⅡ并不完全一致。本研究為腫瘤分化程度及Warburg效應(yīng)相關(guān)性提供了潛在證據(jù)，并為前列腺治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。然而這些結(jié)論還需要擴(kuò)大樣本和體外實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。