石英賢，潘鑫艷，馮 強(qiáng)，鄭慧元，楊舉倫

ras基因是1982年麻省理工學(xué)院Parada等[1]從人膀胱癌細(xì)胞中分離獲得的第一個(gè)人類癌基因。約30%的腫瘤中存在ras基因突變[2]。p21Ras蛋白是ras基因表達(dá)產(chǎn)物。ras基因突變產(chǎn)生的突變型p21Ras蛋白不易被GTP水解，使ras信號(hào)通路持續(xù)激活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和惡變[3]。野生型p21Ras蛋白的過(guò)表達(dá)也可持續(xù)激活ras信號(hào)通路導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[4]。因此，研發(fā)抗p21Ras蛋白抗體對(duì)于ras基因驅(qū)動(dòng)腫瘤的診斷和治療具有重要意義。該文結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)抗p21Ras蛋白單克隆抗體、單鏈抗體、細(xì)胞內(nèi)抗體、重組抗體的研發(fā)和應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1 抗p21Ras抗體的研發(fā)

1.1 抗p21Ras單克隆抗體單克隆抗體是針對(duì)抗原分子上某一特定抗原決定簇的抗體，采用雜交瘤技術(shù)制備[5]。20世紀(jì)80年代是抗p21Ras單克隆抗體研究的高峰時(shí)期。Furth等[6]以H-p21Ras為免疫原制備獲得了8株抗p21Ras單克隆抗體，這些抗體均能與磷酸化和非磷酸化的H-p21Ras蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，其中Y13-259、Y13-128、Y13-4還能與K-p21Ras蛋白結(jié)合。Hand等[7]以H-ras基因產(chǎn)物中10-17位氨基酸組成的肽段為免疫原，制備了5株抗p21Ras蛋白單克隆抗體，依次命名為RAP-1～5。1988年Yoshida等[8]將大腸桿菌表達(dá)的K-p21Ras蛋白作為免疫原制備了16株小鼠單克隆抗體，依次命名為RASK-1～16。1986年Kuzumaki等[9]使用大腸桿菌表達(dá)的H-p21Ras蛋白作為免疫原制備了4株抗p21Ras單克隆抗體，分別命名為rp-12、rp-28、rp-35、rp-38。本實(shí)驗(yàn)室于2009年成功制備了可與H-p21Ras、K-p21Ras，N-p21Ras結(jié)合的廣譜單克隆抗體KGH-R1[10]。

1.2 抗p21Ras單鏈抗體單鏈抗體由抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過(guò)15～20個(gè)氨基酸的短肽連接而成[11]。單鏈抗體較好地保留單克隆抗體與抗原結(jié)合的活性，分子量只有單克隆抗體的1/6，且由于沒(méi)有單克隆抗體的Fc片段不會(huì)導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)，具有作為治療性抗體的優(yōu)勢(shì)。

抗p21Ras單鏈抗體Y238-scFv和Y259-scFv均由相應(yīng)單克隆體衍生而來(lái)，兩者與p21Ras蛋白都有較好的免疫反應(yīng)性，能結(jié)合腫瘤細(xì)胞中的p21Ras蛋白[12]。Lener等[13]利用噬菌體展示技術(shù)從兩個(gè)不同抗體片段文庫(kù)中篩選出5個(gè)不同序列的p21Ras單鏈抗體，這些單鏈抗體經(jīng)親和層析純化后與p21Ras蛋白有較好的親和力，能有效地抑制野生型或突變型ras的功能。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)獲得了抗p21Ras蛋白的單鏈抗體，命名為KGH-R1 scFv[14]。酶聯(lián)免疫吸附法、免疫組化、印跡雜交、免疫熒光、同源模建和分子對(duì)接研究顯示，KGH-R1 scFv與野生型和突變型的H-p21Ras、K-p21Ras、N-p21Ras產(chǎn)生較好的免疫結(jié)合[15]。

1.3 抗p21Ras細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞內(nèi)抗體是一種攜帶抗體基因的表達(dá)載體，進(jìn)入細(xì)胞后在細(xì)胞中將所攜帶的抗體基因表達(dá)為抗體。常用的基因表達(dá)載體有表達(dá)質(zhì)粒和腺病毒。Cochet等[12]將Y259-scFv基因插入Ad5型腺病毒載體中，獲得了細(xì)胞內(nèi)抗體Ad-Y259-scFv。2016年本實(shí)驗(yàn)室將KGH-R1 scFv的基因克隆到復(fù)制缺陷型Ad5型腺病毒載體中，獲得細(xì)胞內(nèi)抗體KGHV100(或重組腺病毒KGHV100)，可以感染具有柯薩奇受體的細(xì)胞并在胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)KGH-R1 scFv[16]。

1.4 抗p21Ras重組抗體重組抗體也稱為基因工程抗體，是通過(guò)DNA重組技術(shù)將抗體基因序列進(jìn)行改造和重組，構(gòu)建于表達(dá)質(zhì)粒上，再通過(guò)蛋白外源表達(dá)技術(shù)將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到適合的宿主細(xì)胞中表達(dá)而獲得。本實(shí)驗(yàn)室將上述KGH-R1 scFv基因與腫瘤穿膜肽基因連接，克隆到表達(dá)質(zhì)粒上，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，獲得三種抗p21Ras重組抗體，分別名為RGD-KGH-R1 scFv、ACPP-KGH-R1 scFv、BR2-KGH-R1 scFv。其中RGD-KGH-R1 scFv可穿入表面有整合素的腫瘤細(xì)胞[17]，ACPP-KGH-R1 scFv可穿入表面有基質(zhì)金屬蛋白酶2的腫瘤細(xì)胞[18]，BR2-KGH-R1 scFv可穿入表面有神經(jīng)節(jié)苷脂的腫瘤細(xì)胞[19]。2017年Shin等采[20]用同樣方法將RGD10細(xì)胞穿膜肽與抗p21Ras單克隆抗體基因RT11-i連接，在大腸桿菌中獲得重組抗體，該抗體可通過(guò)結(jié)合整合素avb3或avb5進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)仍具有與p21Ras-GTP結(jié)合的特異性。

2 抗p21Ras抗體的應(yīng)用

2.1 在腫瘤病理中的應(yīng)用抗p21Ras抗體主要用于研究ras基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。Hand等[7]使用RAP-1～5單克隆抗體作為一抗，應(yīng)用免疫組化在人類結(jié)腸癌和乳腺癌組織中檢測(cè)到p21Ras蛋白，而在纖維腺瘤和纖維囊性疾病、正常乳腺和結(jié)腸上皮組織中未檢測(cè)到p21Ras蛋白。Yoshida等[8]應(yīng)用RASK-3單克隆抗體、通過(guò)免疫組化檢測(cè)101例胃癌、53例非癌胃組織中p21Ras的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)于高分化胃癌、腸化生和不典型增生胃組織中。Kuzumaki等[9]利用rp-12單克隆抗體、通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)：p21Ras蛋白在人黑色素瘤中高表達(dá)，在普通痣中無(wú)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用KGH-R1單克隆抗體分析p21Ras在結(jié)直腸良惡性病變[21]、乳腺良惡性病變[22]、胃黏膜良惡性病變[23]、甲狀腺良惡性病變[24]、肺良惡性病變[25]及肝臟良惡性病變中的表達(dá)[26]，結(jié)果顯示p21Ras在癌組織中高表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，提示ras基因在這些腫瘤的發(fā)生中起重要作用。上述抗體不僅可用于評(píng)價(jià)良、惡性病變組織中p21Ras表達(dá)的差異，還為研究ras基因在細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控和腫瘤轉(zhuǎn)化中的作用提供重要的工具。目前商品化的抗p21Ras抗體有K-p21Ras多克隆抗體RAB(邁新公司)、單克隆抗體c-4(Santa Cruz公司)、重組抗體EP1125Y(Abcam公司)等。

2.2 在腫瘤治療中的應(yīng)用目前，治療性抗p21Ras抗體仍處于研發(fā)階段，尚無(wú)靶向p21Ras的抗體藥物上市。細(xì)胞內(nèi)抗體KGHV100是基于復(fù)制缺陷型腺病毒構(gòu)建，能夠攜帶抗體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，但不能持續(xù)表達(dá)。為此，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了攜帶KGH-R1 scFv基因的腫瘤特異性增殖腺病毒KGHV300[27]和KGHV500[28-29]。KGHV300可在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制增殖，而在正常細(xì)胞中不復(fù)制，延長(zhǎng)了基因表達(dá)時(shí)限，提高了治療效果。KGHV500可在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并持續(xù)表達(dá)KGH-R1 scFv基因，研究顯示它能在體內(nèi)、外抑制結(jié)直腸癌[30]、胃癌[31]、非小細(xì)胞肺癌[32]、腦膠質(zhì)瘤[33]、肝癌[34]的增殖和生長(zhǎng)。用CIK細(xì)胞作為二級(jí)載體，可以通過(guò)血液途徑將KGHV500運(yùn)送到腫瘤部位，為體內(nèi)臟器腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療提供了可能性。連接細(xì)胞穿膜肽抗p21Ras的重組抗體RGD-KGH-R1 scFv、ACPP-KGH-R1 scFv、BR2-KGH-R1 scFv，在肺癌、結(jié)直腸癌、腦膠質(zhì)瘤等腫瘤的研究中顯示了較好的抗腫瘤活性[17-19]。

3 結(jié)語(yǔ)

ras基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[35]。目前，針對(duì)p21Ras蛋白的小分子化合物抑制劑AMG 510已經(jīng)上市，MRTX 849已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，抗體藥物仍處于研發(fā)階段[36-38]?？筽21Ras單克隆抗體能夠用于檢測(cè)正常組織和腫瘤組織中p21Ras的表達(dá)以輔助病理診斷。腺病毒攜帶抗p21Ras抗體基因進(jìn)入細(xì)胞后，能夠在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗p21Ras抗體。然而，腺病毒的制備及保存較為困難，且不利于規(guī)?；a(chǎn)。與細(xì)胞穿膜肽融合表達(dá)的重組抗體有望成為治療ras基因驅(qū)動(dòng)腫瘤的抗體藥物，其開(kāi)發(fā)和規(guī)模化生產(chǎn)將給ras相關(guān)腫瘤患者帶來(lái)福音。