王海霞，林黎娟,2

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球第五大常見癌癥，每年新發(fā)病例約70萬人，我國發(fā)病例數(shù)占全球總病例數(shù)的55%[1-4]。NAD(P)H：醌氧化還原酶1[NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1, NQO1]是一種同源二聚體黃素酶，編碼于染色體16q22，以NADH或NADPH為底物，直接將醌還原為對苯二酚[5]。NQO1的功能包括異源解毒、清除超氧物和維持內(nèi)源性抗氧化維生素，因此NQO1在保護(hù)正常細(xì)胞免受氧化損傷和癌變方面起著重要作用[6]。NQO1基因或基因多態(tài)性的破壞可增加惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險[7-9]。因此，本實驗采用RT-PCR和免疫組化染色檢測HCC和正常肝組織中NQO1的表達(dá)，以驗證NQO1過表達(dá)在HCC預(yù)后評估中的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取遼東學(xué)院醫(yī)學(xué)院病理與腫瘤組織庫中2007～2012年術(shù)后石蠟包埋HCC組織156例，其中23例包含癌旁肝組織。156例HCC患者年齡25～77歲，平均50.4歲；男女比為121∶35；臨床分期根據(jù)AJCC第6版分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ+Ⅱ期65例、Ⅲ+Ⅳ期91例?；颊咝g(shù)前均未行化、放療。隨訪截至2018年3月，109例死亡，47例存活，中位生存時間37個月。

1.2 RNA提取與qRT-PCR從遼東學(xué)院醫(yī)學(xué)院病理與腫瘤組織庫中選取14例HCC與10例正常肝組織新鮮標(biāo)本(肝良性病變切除組織石蠟包埋后亦行后續(xù)免疫組化染色)。使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄酶引物合成第一鏈cDNA和低聚糖(dT)。在20 μL反應(yīng)物中進(jìn)行PCR反應(yīng)，94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 15 min，53～58 ℃ 30 s，23～36個循環(huán)；72 ℃延長1 min，在3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳；用Champchemi專業(yè)圖像分析系統(tǒng)(中國賽智公司)和LANE 1D軟件對蛋白條帶進(jìn)行量化(中國賽智公司)。qRT-PCR是由Bio-Rad序列檢測系統(tǒng)根據(jù)制造商的指示使用雙鏈DNA-specific SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒(日本TaKaRa公司)進(jìn)行，用比較Ct值法(2-ΔΔCt)測定基因相對表達(dá)量。NQO1：上游引物5′-GGCAGAGAGCACTGATCGTA-3′，下游引物5′-TGATGGATTGAGATTCAGC-3′；用GAPDH作為內(nèi)參：上游引物5′-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，下游引物5′-ATACCAGGAAATGAGCTTGA-3′。實驗至少重復(fù)3次。

1.3 組織芯片制作及免疫組化組織陣列塊在52 ℃恒溫烤箱中加熱融合，用全自動組織切片機(德國徠卡公司)用全自動組織切片機以240 μm/rpm的進(jìn)刀速度對組織陣列塊進(jìn)行切片，切片裱附在防脫片處理的進(jìn)口載玻片上，陣列切片置于60 ℃恒溫烤箱中烤片16 h，置于冰箱5 ℃保存。

免疫組化染色采用SP法。組織芯片常規(guī)脫蠟、梯度乙醇入水。75～85 ℃枸櫞酸抗原修復(fù)液處理20 min，室溫冷卻45 min以上。3%H2O2處理10 min，PBS緩沖液清洗，加入一抗NQO1(1∶500)，4 ℃冰箱過夜。次日，加入免疫組化兩步法檢測試劑盒中的試劑1和試劑2，時間分別為25 min和30 min，經(jīng)PBS清洗后，DAB顯色，Mayer蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封固，鏡下觀察。為證明NQO1蛋白抗體免疫組化檢測的特異性，應(yīng)用鼠IgG代替一抗作為對照，結(jié)果為陰性；選擇已知NQO1蛋白陽性的切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

結(jié)果判讀：NQO1僅胞質(zhì)表達(dá)模式為陽性染色。陽性細(xì)胞無或<5%為(-)，5%～25%為(+)，26%～50%為()，>50%為()，以(+～)為陽性。進(jìn)一步將NQO1表達(dá)分為兩組：其中(-和+)為低表達(dá)組，(和)為高表達(dá)組。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。用卡方檢驗和Fisher精確檢驗評價NQO1表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性，Kaplan-Meier法計算腫瘤切除后的無瘤生存率和5年生存率，采用對數(shù)秩檢驗分析生存曲線的差異，采用Cox比例風(fēng)險回歸模型對單變量生存分析的所有顯著特征進(jìn)行多變量生存分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC中NQO1 mRNA的表達(dá)qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，14例HCC中NQO1 mRNA的表達(dá)水平明顯高于10例新鮮正常肝組織(P<0.01，圖1)。

圖1 不同肝組織中NQO1 mRNA的表達(dá)

2.2 HCC組織中NQO1蛋白的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，NQO1蛋白在HCC中呈嚴(yán)格的胞質(zhì)染色模式，總陽性率為86.42%(132/156)，其中高表達(dá)率為58.97%(92/156)，明顯高于癌旁非腫瘤組織(陽性率30.43%，高表達(dá)率21.74%)和正常肝組織(陽性率10.00%，高表達(dá)率10.00%)(P均<0.01，圖2，表1)。

圖2 NQO1蛋白在肝細(xì)胞癌及癌旁組織中的表達(dá)，SP法：A. NQO1在癌旁組織中呈()；B. NQO1在癌旁組織中呈(+)；C. NQO1在伴有血管侵犯的肝細(xì)胞癌組織中呈()；D. NQO1在不伴有血管侵犯的肝細(xì)胞癌組織中呈(+)

2.3 NQO1表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系為評估NQO1蛋白在HCC進(jìn)展中的作用，本組分析了NQO1蛋白表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示，NQO1表達(dá)與腫瘤直徑(P=0.009)、pTNM分期(P=0.002)和血管浸潤(P=0.001)密切相關(guān)，而與HCC患者年齡、性別、AFP水平和HBsAg狀態(tài)均無相關(guān)性(P>0.05，表2)。

表2 NQO1表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的相關(guān)性

2.4 NQO1表達(dá)和HCC患者預(yù)后的關(guān)系采用Kaplan-Meier法分析156例HCC患者的無瘤生存率和總生存率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NQO1高表達(dá)HCC患者的無瘤生存率(Log-rank=12.168，P<0.001)和總生存率(Log-rank=13.009，P<0.001)均低于NQO1低表達(dá)者(圖3)。

圖3 Kaplan-Meier分析HCC中NQO1蛋白表達(dá)與患者無瘤生存率(A)及總生存率(B)的關(guān)系

為進(jìn)一步證實NQO1表達(dá)在HCC進(jìn)展中的重要性，本實驗分析了不同pTNM分期亞組中NQO1表達(dá)與HCC患者預(yù)后的關(guān)系。在pTNM分期Ⅰ+Ⅱ期HCC中，患者無瘤生存率和總生存率與NQO1表達(dá)狀態(tài)無關(guān)(P=0.204、0.177，圖4A、B)。在pTNM分期Ⅲ+Ⅳ期HCC中，與NQO1低表達(dá)患者相比，NQO1高表達(dá)患者的無瘤生存率和總生存率均較低(P=0.008、0.006，圖4C、D)。

圖4 Kaplan-Meier法聯(lián)合分析肝細(xì)胞癌不同pTNM分期亞組中NQO1表達(dá)與患者無瘤生存率和總生存率的關(guān)系：A、B.pTNM分期Ⅰ+Ⅱ期中，NQO1表達(dá)與患者無瘤生存率(A)、總生存率(B)的關(guān)系；C、D.pTNM分期Ⅲ+Ⅳ期中，NQO1表達(dá)與患者無瘤生存率(C)、總生存率(D)的關(guān)系

2.5 Cox比例風(fēng)險回歸模型分析影響HCC患者預(yù)后的因素Cox單因素分析顯示，NQO1高表達(dá)HCC患者的總生存率顯著低于NQO1低表達(dá)者(P=0.002)。此外，腫瘤直徑(P=0.030)、pTNM分期(P<0.001)和血管侵犯(P=0.001)與總生存率相關(guān)。Cox多變量生存分析結(jié)果表明：NQO1高表達(dá)(HR：1.435，95%CI：1.014～2.032，P=0.042)、腫瘤直徑(HR：1.446，95%CI：1.046～1.999，P=0.026)、pTNM分期(HR：1.823，95%CI：1.313～2.531，P<0.001)、血管侵犯(HR：1.624，95%CI：1.124～2.346，P=0.010)是影響HCC患者預(yù)后的獨立危險因素(表3)。

表3 單因素和多因素分析156例HCC患者總生存率的影響因素

3 討論

NQO1是一種重要的同型二聚體黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的酶[10]。NQO1酶可能對醌類及其代謝前體引起的致癌性、致突變性和細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用[11-14]。NQO1酶的活性高度依賴于NQO1基因位點的多態(tài)性。在NQO1基因中已發(fā)現(xiàn)有93個以上的單核苷酸多態(tài)性，其中研究最廣泛的是NQO1 cDNA第609位核苷酸外顯子中的6處胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)換，以及編碼氨基酸序列第187位脯氨酸(P)到絲氨酸(S)的取代[15]。有研究表明，NQO1 TT基因型導(dǎo)致的蛋白缺乏是多泛素化和蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)的NQO1蛋白T等位基因加速降解所致[16]。與野生型基因型(CC)相比，純合變異基因型(TT)的酶活性僅為醌還原酶活性的2%～4%，而雜合變異基因型的酶活性水平下降了3倍[17]。因此，具有NQO1 C609T同源多態(tài)性的個體可能具有發(fā)展為癌癥的易感性。

最近的研究數(shù)據(jù)也表明，NQO1在HCC中表達(dá)上調(diào)與其在肝細(xì)胞癌變過程中起著重要的細(xì)胞防御作用有關(guān)[9,18]。本實驗qRT-PCR檢測顯示，與正常肝組織相比，HCC中NQO1 mRNA水平顯著升高；免疫組化結(jié)果亦顯示，NQO1蛋白在HCC中的高表達(dá)率為58.97%，明顯高于癌旁肝組織和正常肝組織。這與現(xiàn)有理論相一致，即NQO1在增殖細(xì)胞中含量較高，而在靜止和終末分化細(xì)胞中含量較低[19]。

為驗證NQO1表達(dá)與HCC臨床及預(yù)后的關(guān)系，本組對NQO1蛋白表達(dá)和臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示NQO1蛋白表達(dá)與腫瘤大小、pTNM分期、血管侵犯顯著相關(guān)，而與患者AFP、HBsAg水平無關(guān)。此外，在生存率方面發(fā)現(xiàn)NQO1高表達(dá)HCC患者的無瘤生存率和總生存率均低于NQO1低表達(dá)HCC患者；在pTNM分期Ⅲ+Ⅳ期HCC患者中，與NQO1低表達(dá)者相比，NQO1高表達(dá)者的無瘤生存率和總生存率明顯降低。Cox多變量生存分析顯示，NQO1表達(dá)、pTNM分期和血管侵犯是影響HCC患者總生存率的獨立風(fēng)險因素。因此，NQO1可以做為評價HCC患者預(yù)后的獨立生物標(biāo)志物。

NQO1基因作為一個氧化應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，在惡性腫瘤中高表達(dá)的作用機制尚不十分清楚。Asher等[20]認(rèn)為，NQO1酶與TP53抑癌基因的穩(wěn)定有關(guān)，并保護(hù)其不受20S蛋白酶體降解的影響，導(dǎo)致致癌結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡增加，從而阻止這些細(xì)胞發(fā)展為腫瘤狀態(tài)；另外，NQO1 C609T多態(tài)性導(dǎo)致的NQO1活性降低可能會降低肝細(xì)胞中p53水平，減少細(xì)胞凋亡，增加基因組不穩(wěn)定性，從而增加肝癌的易感性。本實驗結(jié)果可以解釋為NQO1在作用于某些底物時可能起到保護(hù)作用，但在作用于其他底物時可能有助于致癌。

綜上，NQO1在HCC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，可作為HCC預(yù)后評估的獨立生物標(biāo)志物。本組后續(xù)將對其主要的作用機制做深入探討。