黃家利，徐 暢，吳 虹，葛 頌，王飛通，牛 堅

肝細(xì)胞癌病死率較高[1]，預(yù)后較差，5年生存率低于5%[2]。早期診斷對提高肝細(xì)胞癌患者的總生存率具有重要意義，晚期患者也亟需新的治療方案。異染色質(zhì)蛋白1結(jié)合蛋白3(heterochromatin protein 1 binding protein 3, HP1BP3)是一種與組蛋白H1有關(guān)的蛋白。HP1BP3的染色質(zhì)結(jié)合動力學(xué)與H1相似，參與異染色質(zhì)的合成[3-5]。有研究表明，HP1BP3參與維持異染色質(zhì)的完整性及細(xì)胞周期調(diào)控[6]。此外，HP1BP3特異性結(jié)合內(nèi)源性pri-miRNAs，促進(jìn)人類細(xì)胞miRNA的產(chǎn)生[7]。HP1BP3促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8-10]。目前HP1BP3與肝細(xì)胞癌的相關(guān)性研究較少。本實驗利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析HP1BP3基因與肝細(xì)胞癌的關(guān)系，體外細(xì)胞實驗加以驗證，通過GSEA富集分析可能的相關(guān)信號通路及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)獲取376例人肝細(xì)胞癌組織和50例正常肝組織的HP1BP3表達(dá)數(shù)據(jù)及相關(guān)臨床資料，將HP1BP3表達(dá)數(shù)據(jù)與患者臨床資料相結(jié)合，以HP1BP3表達(dá)的中位數(shù)為界值，將所有肝細(xì)胞癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組進(jìn)行生存分析。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)正常肝組織細(xì)胞系LO2、肝癌細(xì)胞系HepG2及Huh7購自上海中國科學(xué)院類型培養(yǎng)庫。所有細(xì)胞通過STR圖譜進(jìn)行鑒定。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.3 基因沉默HP1BP3 siRNA oligos購自吉瑪基因公司(http: //www.genepharma.com)。使用siRNA oligos作為陰性對照。采用riboFECT CP Reagent轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。37 ℃孵育，轉(zhuǎn)染24～48 h后進(jìn)行后續(xù)實驗，CCK-8、集落形成、侵襲、遷移等功能實驗，48 h后提取細(xì)胞蛋白，Western blot法檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4 CCK-8實驗分別將Huh7、HepG2按照1.5×104個/孔接種于96孔板，在5%CO2、37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。在每日指定時間點加入CCK-8試劑10 μL，連續(xù)4天，在5%CO2、37 ℃恒溫箱中孵育2 h后，用Synergy Mx多模式微板儀測定450 nm處的吸光度[12]。

1.5 集落形成試驗細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中(2×104個/皿)，37 ℃培養(yǎng)2～3周，用PBS洗滌，4%多聚甲醛室溫固定1 h，室溫下0.1%結(jié)晶紫染色30 min，鏡下觀察。陽性集落形成定義為集落>50個細(xì)胞。

1.6 Transwell侵襲、遷移試驗將細(xì)胞分為兩組，侵襲組預(yù)涂10 μL Matrigel模擬細(xì)胞基底層，遷移組不預(yù)涂。將每200 μL含2×104個細(xì)胞的無血清DMEM細(xì)胞懸液加入上室，下室中加入10%胎牛血清的DMEM。37 ℃孵育48 h后，用PBS沖洗3次，用棉簽輕輕擦去上室中的非侵襲性細(xì)胞。侵襲細(xì)胞加入4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫室溫下染色20 min。倒置顯微鏡下觀察，軟件計數(shù)，隨機(jī)拍攝。

1.7 免疫組化12例組織切片購自徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院(倫理號：XYFY2019-KL129-01)，依次經(jīng)100%二甲苯、梯度乙醇(100%、95%、85%、75%、50%)脫蠟后抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶封閉。用PBS洗滌3次后，加入一抗HP1BP3(1 mg/mL，稀釋500倍)4 ℃孵育過夜，再加入二抗孵育20 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染。切片經(jīng)50%、75%、85%、95%、100%乙醇和100%二甲苯脫水5 min，中性樹膠封固，鏡下觀察。

1.8 Western blot法用RIPA裂解緩沖液提取各細(xì)胞系中蛋白質(zhì)，用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。用7.5%～10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白(50 μg)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下用3%牛血清白蛋白封閉緩沖液封閉2 h，加入一抗HP1BP3(1 mg/mL，稀釋1 000倍)，4 ℃孵育過夜。用1×TBST洗膜10 min，合計3次。室溫下將HRP標(biāo)記的親和純羊抗兔IgG(H+L)二抗與膜孵育1～2 h，用TBST洗滌后，用BeyoECL Plus進(jìn)行檢測，化學(xué)發(fā)光顯影。用Image J軟件對條帶密度進(jìn)行量化。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用R包(v3.6.1)對TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用Wilcoxon signed-rank檢驗分析HP1BP3在TCGA隊列肝細(xì)胞癌和正常肝組織中的表達(dá)差異。采用Kaplan-Meier生存分析HP1BP3表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者總生存率關(guān)系。采用單變量Cox分析來選擇可能的預(yù)后變量。單因素分析確定的變量P<0.05作為多因素Cox分析的候選變量。采用Cox比例風(fēng)險模型，通過多因素分析確定獨立的預(yù)后因素。采用GraphPad Prism 5.01軟件中配對t檢驗對CCK-8實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行兩組間對比分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.10 基因富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)使用TCGA隊列的GSEA分析確定HP1BP3表達(dá)對肝細(xì)胞癌預(yù)后影響的潛在機(jī)制。以分子簽名數(shù)據(jù)庫(MSigDB)中的C2(c2.cp.kegg.v7.0.symbs.gmt)作為參考基因集。應(yīng)用GSEA評估HP1BP3高表達(dá)組和HP1BP3低表達(dá)組之間的生存差異。每次分析中的基因集排列進(jìn)行1 000次，若P<0.05則認(rèn)為基因集顯著富集。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫肝細(xì)胞癌中HP1BP3的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系TCGA數(shù)據(jù)庫分析示：肝細(xì)胞癌組織中HP1BP3表達(dá)較癌旁正常組織顯著上調(diào)(P<0.001，圖1A)。HP1BP3高表達(dá)患者總生存期較低表達(dá)組低(P=0.029，圖1B)，提示HP1BP3表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)。Cox單因素分析示：Stage分期、T分期、M分期和HP1BP3表達(dá)是影響肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的因素(P<0.05)。Cox多因素分析示：HP1BP3表達(dá)是肝細(xì)胞癌患者總生存期的獨立預(yù)后因素(表1)。

圖1 A.TCGA數(shù)據(jù)庫分析HP1BP3在肝細(xì)胞癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)；B. HP1BP3表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系

表1 單因素和多因素Cox回歸分析

2.2 HP1BP3在體外肝癌細(xì)胞系及肝癌組織中的表達(dá)差異應(yīng)用Western blot和免疫組化法分別檢測細(xì)胞及組織中HP1BP3蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞系中HP1BP3蛋白表達(dá)高于正常肝細(xì)胞系(P<0.001，圖2A)；免疫組化結(jié)果顯示：HP1BP3陽性9例，陰性3例，陽性組癌組織較癌旁組織棕黃色染色深，兩者免疫組化評分有差異(圖2B)。

圖2 A.Western blot法檢測HP1BP3在肝細(xì)胞株中的表達(dá)：**P<0.001；B.免疫組化檢測HP1BP3蛋白在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，較癌旁正常組織表達(dá)高，表達(dá)定位于細(xì)胞核，PV兩步法

2.3 沉默HP1BP3對人肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響分別轉(zhuǎn)染HP1BP3 siRNA至Huh7、HepG2細(xì)胞中以沉默HP1BP3表達(dá)，應(yīng)用Western blot法檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染HP1BP3 siRNA的肝癌細(xì)胞中HP1BP3表達(dá)降低，證明轉(zhuǎn)染成功(P<0.05，圖3)。細(xì)胞功能實驗結(jié)果：CCK-8(圖4A)和集落形成實驗(圖4B)表明，沉默HP1BP3后的細(xì)胞增殖率和細(xì)胞存活率均低于對照組(P<0.05)；Transwell圖像及定量分析表明，與對照組相比，沉默HP1BP3后Huh7、HepG2細(xì)胞的遷移、侵襲能力受到抑制(圖5)。上述實驗表明，沉默HP1BP3可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。

圖3 Western blot法驗證Huh7(A)、HepG2(B)中HP1BP3 siRNA的轉(zhuǎn)染效率

圖4 A.CCK-8實驗：沉默HP1BP3后實驗組Huh7、HepG2細(xì)胞較對照組細(xì)胞增殖能力降低，**P<0.001；B.集落形成實驗：沉默HP1BP3后實驗組Huh7、HepG2細(xì)胞較對照組細(xì)胞增殖能力降低，同CCK-8實驗結(jié)果相一致

圖5 A.遷移實驗：沉默HP1BP3后實驗組Huh7、HepG2細(xì)胞組較對照組細(xì)胞穿過小室聚碳酸酯膜數(shù)量少，細(xì)胞遷移能力降低；B.侵襲實驗：沉默HP1BP3后實驗組Huh7、HepG2細(xì)胞較對照組細(xì)胞穿過基底膠數(shù)量少，細(xì)胞侵襲能力降低

2.4 GSEA篩選肝細(xì)胞癌中HP1BP3相關(guān)信號通路通過GSEA對HP1BP3高表達(dá)進(jìn)行富集分析，識別肝細(xì)胞癌中激活的信號通路，結(jié)果顯示在泛素化、核酸切除修復(fù)、RNA降解、ERBB信號通路、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡通路中，HP1BP3高表達(dá)富集(表2)。

表2 表型高度富集的基因集

3 討論

P1BP3是細(xì)胞生長發(fā)育不可或缺的組成部分。分。Garfinkel等[4]指出，HP1BP3是H1組蛋白多基因家族成員，廣泛存在于組織和細(xì)胞胞核中，以異染色質(zhì)蛋白1(heterochromatin protein 1, HP1)依賴性方式參與異染色質(zhì)的合成，HP1BP3缺失影響蛋白的表達(dá)。另有研究證實，HP1BP3可以維持異染色質(zhì)完整性，通過促進(jìn)G1-S轉(zhuǎn)變參與細(xì)胞周期的調(diào)控[6]，HP1BP3在G1-S進(jìn)展期間通過將常染色質(zhì)和異染色質(zhì)相互轉(zhuǎn)化來激活或沉默特定基因，從而調(diào)節(jié)G1期的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以維持細(xì)胞周期進(jìn)程。除此之外，Liu等[7]通過細(xì)胞機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，HP1BP3可以特異性結(jié)合內(nèi)源性pri-miRNAs，促進(jìn)體內(nèi)DROSHA/pri-miRNA的結(jié)合，從而促進(jìn)人類細(xì)胞miRNA產(chǎn)生，HP1BP3缺失則導(dǎo)致pri-miRNAs從染色質(zhì)中過早釋放，破壞pri-miRNA的加工。以上研究揭示了HP1BP3的基礎(chǔ)功能，但其與臨床的聯(lián)系及意義少有報道，本文采用TCGA數(shù)據(jù)庫收集臨床數(shù)據(jù)，通過檢驗分析發(fā)現(xiàn)HP1BP3與肝細(xì)胞癌相關(guān)，且在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)；生存分析顯示，HP1BP3低表達(dá)組較HP1BP3高表達(dá)組生存期長，單因素及多因素分析發(fā)現(xiàn)HP1BP3是肝細(xì)胞癌的獨立預(yù)后因素。以上表明HP1BP3與肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

有研究證實，HP1BP3是腫瘤發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)因素，有促進(jìn)癌細(xì)胞活力、自我更新和治療抗性作用[8-9]。已有研究發(fā)現(xiàn)，HP1BP3在食管癌中可通過上調(diào)miR-23a靶向TRAF5促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[10]。然而，目前尚未見其在肝細(xì)胞癌中的研究報道。本實驗通過體外細(xì)胞實驗及免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，HP1BP3在癌細(xì)胞中表達(dá)較正常細(xì)胞增多，同時在癌組織中表達(dá)量較癌旁組織明顯增高，驗證了數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果。進(jìn)一步通過調(diào)低細(xì)胞中HP1BP3基因表達(dá)作為實驗組，在功能實驗中發(fā)現(xiàn)，實驗組細(xì)胞相較于對照組在細(xì)胞增殖、遷移和侵襲方面均明顯減弱，這表明HP1BP3可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性行為，或許可以作為篩查肝細(xì)胞癌、預(yù)測肝細(xì)胞癌患者預(yù)后及治療靶點的潛在指標(biāo)。

本組通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，HP1BP3可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌IGF-1成分的轉(zhuǎn)錄對機(jī)體生長和骨骼發(fā)育起關(guān)鍵作用[11]。同時有研究證實，HP1BP3參與維持異染色質(zhì)完整性，通過促進(jìn)G1-S轉(zhuǎn)變參與細(xì)胞周期調(diào)控[6]，HP1BP3在G1-S進(jìn)展期間通過將常染色質(zhì)和異染色質(zhì)相互轉(zhuǎn)化來激活或沉默特定基因來調(diào)節(jié)G1期的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以維持細(xì)胞周期進(jìn)程。有研究發(fā)現(xiàn)HP1BP3與認(rèn)知及細(xì)胞衰老相關(guān)[12-14]。本組通過GSEA[15]篩選出與HP1BP3高表達(dá)可能相關(guān)的泛素化、核酸切除修復(fù)、RNA降解、ERBB信號通路、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡通路。上述結(jié)果可與已有報道相印證，作為后續(xù)HP1BP3機(jī)制研究的依據(jù)，可以以細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡[16]為切入點探究其影響肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，為HP1BP3基因的深入研究提供參考。

綜上，HP1BP3可以促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，是影響肝細(xì)胞癌預(yù)后的獨立危險因素。此外，HP1BP3在肝細(xì)胞癌中可能參與了泛素化、核酸切除修復(fù)、RNA降解、ERBB信號通路、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡通路，可作為下一步研究方向的參考。本實驗仍存在不足之處，數(shù)據(jù)分析未從多個數(shù)據(jù)庫聯(lián)合驗證，體外實驗未進(jìn)行恢復(fù)驗證，未來可以從多數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析，調(diào)低目的基因后再進(jìn)行恢復(fù)驗證。