張 英，侯偉娜，孫 琦，張 瑩，李曉景，任曉華，謝克讓，安翠平

(1.石家莊市第一醫(yī)院藥劑科，石家莊 050011； 2.石家莊市第一醫(yī)院輸血科，石家莊 050011)

肝內(nèi)膽汁淤積是由于機(jī)體內(nèi)膽紅素代謝障礙引起的一種病理生理過程，是引起肝功能損傷的一種常見致病因素[1]。核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路是參與炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要信號(hào)通路，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)膽汁淤積的疾病進(jìn)展及預(yù)后與NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)異常密切相關(guān)[2-3]。大黃來源于掌葉大黃(RheumpalmatumL.)、藥用大黃(RheumoffcinaleBaill.)和唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim.ex Balf.)的干燥根和根莖，具有抗炎、抗腫瘤和調(diào)節(jié)胃腸功能紊亂等藥理作用[4]。大黃對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積具有顯著療效[5-6]。大黃免煎顆粒是由大黃飲片制成的新制劑，具有與大黃飲片等效的藥理活性及作用[7]。本研究探討了大黃免煎顆粒對(duì)α-萘異硫氰酸酯(ANIT)誘導(dǎo)的肝內(nèi)膽汁淤積大鼠氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)及NF-κB通路的調(diào)節(jié)作用，旨在為大黃免煎顆粒的藥理作用研究及其對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)SD大鼠60只，雄性，6～8周齡，體重180～220 g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(冀)2018-004]，飼養(yǎng)于動(dòng)物房，溫度20～24 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。

1.2 儀器

ERM3000型石蠟切片機(jī)(常州市郝思琳醫(yī)用儀器有限公司)；FLUOstar OPTIMA型多功能酶標(biāo)儀(香港伯齊科技有限公司)；CKX41-F32FL型熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Allegra X-30型臺(tái)式離心機(jī)[貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司]；E-Gel Imager型凝膠成像儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]。

1.3 藥品與試劑

大黃免煎顆粒(每2.5 g相當(dāng)于原藥材6 g，廣東一方制藥有限公司，批號(hào)為091108)；ANIT(西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司，批號(hào)為140018)；熊去氧膽酸(德國Losan Pharma GmbH公司，規(guī)格為250 mg，批號(hào)為180915)；NF-κB p65(貨號(hào)：AF0246)及p-NF-κB p65(貨號(hào)：AF5875)兔多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG，貨號(hào)：A0208)和GAPDH兔單克隆抗體(貨號(hào)：AF1186)，均購自碧云天生物科技有限公司；伊紅染液(貨號(hào)：Y13 M6C2)、蘇木精染液(貨號(hào)：J28N6Y6648)，均購自源葉生物科技有限公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號(hào)：PE0010)、RIPA蛋白裂解液(貨號(hào)：R0010)，均購自北京索萊寶科技有限公司；SOD活性(WST-8法)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：ab65354)、MDA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：ab118970)，均購自艾博抗貿(mào)易有限公司。

1.4 肝內(nèi)膽汁淤積大鼠模型的建立

將ANIT 1 g溶于色拉油50 mL中，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的ANIT。除15只大鼠作為對(duì)照組外，其余45只大鼠參照文獻(xiàn)[8]的方法灌胃給予2% ANIT 100 mg/kg，建立肝內(nèi)膽汁淤積大鼠模型，以大鼠血清堿性磷酸酶(ALP)、谷酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、總膽紅素(TBIL)和直接膽紅素(DBIL)水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)作為造模成功標(biāo)志。對(duì)照組大鼠給予色拉油。造模完成后分為模型組、大黃免煎顆粒組及陽性對(duì)照組，大黃免煎顆粒組大鼠按照4 g/kg的劑量灌胃給予大黃免煎顆粒[9]，陽性對(duì)照組大鼠灌胃給予熊去氧膽酸(100 mg/kg)[10]，對(duì)照組及模型組大鼠給予0.9%氯化鈉溶液，均1日1次，連續(xù)28 d[11]。

1.5 大鼠血清指標(biāo)水平的測(cè)定

每組取15只大鼠，眼眶取血后，于4 ℃冰箱靜置4 h，4 ℃條件下，3 500 r/min離心(離心半徑15 cm)10 min，取上清液，使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、ALP、GGT、TBIL和DBIL水平。

1.6 大鼠肝組織超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平的測(cè)定

每組取6只大鼠，頸椎脫臼法處死后分離肝組織，用4 ℃預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液對(duì)肝組織灌流清洗后，置于組織勻漿器中，加入蒸餾水研磨勻漿，4 ℃條件下，8 000 r/min離心(離心半徑15 cm)10 min，取上清液，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測(cè)SOD活性及MDA、GSH水平。

1.7 大鼠肝組織病理學(xué)檢查

取大鼠肝組織，使用4%中性甲醛固定，石蠟包埋，進(jìn)行4 μm切片，依次經(jīng)過脫水、透明處理后，常規(guī)蘇木精-伊紅染色(HE染色)，在顯微鏡下觀察。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)大鼠肝組織NF-κB p65及p-NF-κB p65蛋白水平

每組取6只大鼠，頸椎脫臼法處死后取肝組織，勻漿器充分裂解勻漿，4 ℃條件下，12 000 r/min離心(離心半徑15 cm)10 min，取上清液，使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度；取50 μg蛋白的肝組織勻漿液，上樣至聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離，并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，封閉液室溫(25 ℃)封閉1 h，經(jīng)NF-κB p65、p-NF-κB p65兔多克隆抗體及GAPDH兔單克隆抗體(1∶1 000稀釋)在4 ℃條件下孵育過夜，使用含吐溫的磷酸鹽緩沖液清洗3次，1次5 min，室溫下，使用山羊抗兔IgG抗體(1∶2 000稀釋)孵育1 h，清洗3次，在凝膠成像儀拍照，應(yīng)用Image J 1.8.0軟件進(jìn)行定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TBIL和DBIL水平比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TBIL和DBIL水平顯著升高；與模型組比較，大黃免煎顆粒組、陽性對(duì)照組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TBIL和DBIL水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與大黃免煎顆粒組比較，陽性對(duì)照組大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL和DBIL水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，GGT水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 四組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TBIL和DBIL水平比較

2.2 四組大鼠肝組織SOD活性、MDA及GSH水平比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織MDA、GSH水平顯著升高，SOD活性顯著降低；與模型組比較，大黃免煎顆粒組、陽性對(duì)照組大鼠肝組織MDA、GSH水平顯著降低，SOD活性顯著升高，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與大黃免煎顆粒組比較，陽性對(duì)照組大鼠肝組織SOD活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MDA、GSH水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 四組大鼠肝組織SOD活性、MDA及GSH水平比較

2.3 四組大鼠肝組織病理學(xué)檢查

對(duì)照組大鼠肝組織無明顯病理改變，結(jié)構(gòu)正常；與對(duì)照組比較，模型組大鼠匯管區(qū)膽管增生明顯，上皮細(xì)胞壞死脫落，大量炎癥細(xì)胞浸潤，肝組織損傷嚴(yán)重，中心靜脈充血明顯，中心靜脈區(qū)周圍細(xì)胞壞死，有炎癥細(xì)胞滲入；與模型組比較，大黃免煎顆粒組、陽性對(duì)照組大鼠肝組織病理學(xué)明顯恢復(fù)，膽管擴(kuò)張及增生減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少，上皮細(xì)胞脫落及壞死減輕，肝組織細(xì)胞炎癥浸潤減少；與大黃免煎顆粒組比較，陽性對(duì)照組大鼠肝組織膽管擴(kuò)張減輕，炎癥浸潤略減少，見圖1。

A.對(duì)照組；B.模型組；C.大黃免煎顆粒組；D.陽性對(duì)照組A. control group; B. model group; C. Dahuang granule prescription group; D. positive control group

2.4 四組大鼠肝組織NF-κB p65、p-NF-κB p65水平比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織NF-κB p65、p-NF-κB p65水平顯著升高；與模型組比較，大黃免煎顆粒組、陽性對(duì)照組大鼠肝組織NF-κB p65、p-NF-κB p65水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與大黃免煎顆粒組比較，陽性對(duì)照組大鼠肝組織NF-κB p65、p-NF-κB p65水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05;與大黃免煎顆粒組比較，△P<0.05Note: vs. the control group, *P<0.05; vs. the model group, #P<0.05; vs. the Dahuang granule prescription group, △P<0.05

3 討論

肝內(nèi)膽汁淤積是由于膽汁分泌及排泄障礙引起的肝臟及體循環(huán)膽紅素等膽汁成分的過度堆積，進(jìn)而引起的肝細(xì)胞損傷及肝功能障礙，長期持續(xù)的膽汁淤積會(huì)誘導(dǎo)肝組織發(fā)生纖維化甚至進(jìn)展為肝硬化等嚴(yán)重疾病，目前臨床上常使用熊去氧膽酸等利膽藥進(jìn)行治療，故本研究使用熊去氧膽酸作為陽性對(duì)照藥[12]。ANTI誘導(dǎo)的肝內(nèi)膽汁淤積是目前實(shí)驗(yàn)中建立肝內(nèi)膽汁淤積動(dòng)物模型的一種常用方法。

大黃為常用的中藥材，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為大黃具有瀉熱通腸、涼血解毒和逐瘀通經(jīng)等作用。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃能促進(jìn)肝內(nèi)膽汁淤積大鼠膽汁的排泄，修復(fù)肝損傷[13]；陳鵬等[5]指出，大黃可以緩解肝內(nèi)膽汁淤積所致大鼠肝損傷，且效果優(yōu)于地塞米松及熊去氧膽酸；劉萍等[6]的研究結(jié)果表明，大黃能夠通過促進(jìn)大鼠胃腸消化間期移行性復(fù)合肌電活動(dòng)，進(jìn)而促進(jìn)膽汁淤積大鼠的膽汁排泄。免煎顆粒是由中藥材飲片經(jīng)過加工、提取等工藝制得的新型制劑，已有研究結(jié)果證實(shí)其與傳統(tǒng)藥材飲片藥效學(xué)等同，且具有方便、安全的優(yōu)勢(shì)，在臨床應(yīng)用中受到廣泛認(rèn)可[14]。

ALT、AST、ALP和GGT是臨床常用的反映肝功能的直接指標(biāo)，其水平升高提示肝功能降低及肝細(xì)胞損傷[15]；TBIL、DBIL是體現(xiàn)體內(nèi)膽紅素水平及代謝的指標(biāo)，其水平升高提示體內(nèi)膽汁排泄障礙[16]；SOD、MDA及GSH是機(jī)體氧化應(yīng)激及自我修復(fù)的常用指標(biāo)，SOD活性降低、MDA和GSH水平升高均提示體內(nèi)存在一定程度的氧化應(yīng)激損傷[17]。本研究結(jié)果表明，大黃免煎顆粒組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TBIL和DBIL水平降低，肝組織MDA、GSH水平降低，肝組織SOD活性升高，提示大黃免煎顆粒能夠改善并修復(fù)大鼠肝細(xì)胞的損傷，促進(jìn)膽汁代謝及排泄，緩解肝組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。與陽性對(duì)照藥熊去氧膽酸比較，大黃免煎顆粒組大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL和DBIL水平升高，但仍在正常值范圍內(nèi)，且GGT水平與陽性對(duì)照組相當(dāng)，提示大黃免煎顆粒具有顯著的肝功能恢復(fù)作用；同時(shí)，與熊去氧膽酸組比較，大黃免煎顆粒能夠顯著提高大鼠肝組織SOD活性，提示大黃免煎顆粒較熊去氧膽酸能夠更顯著修復(fù)肝細(xì)胞氧化損傷。

NF-κB信號(hào)通路是肝臟氧化應(yīng)激損傷及炎癥信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵通路之一。近年來的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)膽汁淤積引起的肝細(xì)胞損傷與NF-κB信號(hào)通路改變相關(guān)，抑制NF-κB相關(guān)蛋白的過表達(dá)，能夠減輕肝內(nèi)膽汁淤積大鼠肝臟炎癥損傷，并能夠修復(fù)大鼠胃腸道黏膜[18-19]。本研究結(jié)果表明，大黃免煎顆粒組大鼠肝組織NF-κB p65及p-NF-κB p65水平降低，組織病理學(xué)顯著改善，提示大黃免煎顆粒能夠通過調(diào)節(jié)肝組織細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)肝臟組織病理學(xué)的恢復(fù)，改善肝內(nèi)膽汁淤積大鼠疾病轉(zhuǎn)歸及預(yù)后。同時(shí)，與陽性對(duì)照藥熊去氧膽酸組比較，大黃免煎顆粒組大鼠肝組織NF-κB p65、p-NF-κB p65水平降低更明顯，提示大黃免煎顆粒較熊去氧膽酸具有更顯著的NF-κB信號(hào)通路及蛋白抑制作用，這也提示了大黃免煎顆粒與熊去氧膽酸在作用機(jī)制上存在一定的差異。本研究證實(shí)了大黃免煎顆粒對(duì)于肝內(nèi)膽汁淤積大鼠具有顯著的肝功能修復(fù)作用，并能夠呈劑量依賴性地顯著抑制NF-κB信號(hào)通路及蛋白的磷酸化水平，進(jìn)而抑制大鼠肝組織氧化應(yīng)激損傷，修復(fù)肝組織細(xì)胞功能及病理學(xué)改變，為大黃免煎顆粒在肝內(nèi)膽汁淤積治療中的應(yīng)用提供新的參考，并為大黃免煎顆粒的臨床開發(fā)提供新的證據(jù)。

綜上所述，大黃免煎顆粒能夠明顯修復(fù)大鼠肝功能及肝組織氧化應(yīng)激損傷，改善膽汁代謝水平，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)NF-κB通路有關(guān)。