梁先長 鄧艷芹 田晟 程甲 吳天驕

（湘西自治州疾病預防控制中心 湖南 吉首 416000）

1 前言

肌酐是一種低分子量的含氮化合物，是磷酸肌酸通過脫磷酸基閉合成環(huán)的內(nèi)脫水物[1]，臨床上主要檢測血肌酐和尿肌酐。血中肌酐濃度主要與腎小球濾過率相關(guān)，故血清肌酐的測定是常規(guī)腎功能試驗之一，對于嚴重腎小球病變引起的腎功能不全、腎炎、尿毒癥等的診斷具有重要意義[2]。尿肌酐的排出量能反映身體肌肉質(zhì)量[3]，粗略判斷24 h尿液收集的完整性[4]，還能夠評估人群的蛋白質(zhì)營養(yǎng)情況[5]。由于尿肌酐的排泄量穩(wěn)定，有研究人員推薦采用尿肌酐濃度校正其他檢測值[6]，郭曉慧[7]提出將24 h尿碘排出量的肌酐校正值作為評價學齡兒童個體和人群碘攝入量的指標。在尿液污染物、重金屬研究[8]及估算尿液中農(nóng)藥等環(huán)境有害物質(zhì)[9-10]，以及職業(yè)性汞中毒[11]和鎘中毒[12]診斷標準中，都用到尿肌酐含量校正。

目前，測定尿肌酐的方法有苦味酸分光光度法[13]和反相高效液相法[14]?？辔端岱止夤舛确ǔ杀镜土?、操作簡便，最常用的現(xiàn)場測定方法，但是線性范圍較小（0～1.0 g/L），而《職業(yè)性鎘中毒的診斷》中明確規(guī)定對肌酐濃度小于0.3 g/L或大于3.0 g/L的尿樣應(yīng)重新留取尿樣檢測[12]，故需對部分樣品進行稀釋和二次測定，導致工作量增加。本文通過考察反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、苦味酸加入量對尿中肌酐檢測的影響，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立一種檢測范圍廣、快速準確的尿中肌酐檢測方法，以期為標準方法的更新提供參考依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

尿樣（湘西州職防所）；鹽酸、氫氧化鈉、2，4，6-三硝基苯酚、肌酐（分析純）。試劑配置參考WS/T97-1996尿中肌酐分光光度測定方法[13]。

2.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計（UVmini-1280，配5 mm比色皿，日本島津）；電子分析天平（HZY-AZZO，華志電子科技）；電熱恒溫水浴鍋（DK-98-11A，天津市表斯特儀器）。

2.3 方法

2.3.1 反應(yīng)時間的選擇

選擇肌酐濃度為1.00 g/L，加入2.0 mL苦味酸，在20℃條件下，從反應(yīng)時間15 min開始，每隔2 min測量反應(yīng)溶液的吸光度值，考察反應(yīng)時間對測量吸光度值的影響。

2.3.2 反應(yīng)溫度的選擇

選擇肌酐濃度為1.00 g/L，加入2.0 mL苦味酸，分別在15、20、25、30、35、40、45℃條件下，反應(yīng)30 min，考察反應(yīng)溫度對測量吸光度值的影響。

2.3.3 苦味酸加入量的選擇

選擇肌酐濃度為1.00 g/L，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL苦味酸，在20℃條件下，反應(yīng)30 min，考察苦味酸加入量對測量吸光度值的影響。

配制6套肌酐濃度為0.00、0.10、0.20、0.30、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 g/L的標準系列，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL苦味酸，在20℃條件下，反應(yīng)30min，以吸光度為縱坐標，肌酐濃度為橫坐標，繪制標準曲線，考察肌酐加入量對肌酐反應(yīng)的影響。

2.3.4 正交優(yōu)化試驗

選擇肌酐濃度為1.00 g/L測量吸光度值，綜合單因素試驗結(jié)果，選取反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和苦味酸加入量3個因素，設(shè)計3因素3水平正交分析試驗，試驗設(shè)計因素水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平表

2.3.5 方法學考察

對方法的檢出限、加標回收率和精密度進行考察。

2.4 分析評價

2.4.1 尿中肌酐的測定

肌酐標準溶液0.10 g/L：準確稱取0.100 0 g肌酐（經(jīng)110℃干燥2 h），溶于鹽酸溶液；定量轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，此溶液為1.0 g/L肌酐標準儲備液；用水稀釋成0.1 g/L標準溶液（置于冰箱內(nèi)可保存1個月）。取10支10 mL的具塞比色管，按表2配制標準系列。

表2 肌酐標準系列的配制

同時，取尿樣0.10 mL，置于10 mL具塞比色管中，加入純水至3.0 mL；向各管中加入一定量堿性苦味酸溶液，純水定容后充分搖勻，在一定溫度下反應(yīng)一定時間；以0管作參比，在490 nm波長處，用0.5 mm比色皿上機測定吸光度；以吸光度為縱坐標，肌酐濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.4.2 結(jié)果計算

C=c×f

式中：C——尿中肌酐的濃度（g/L）；c——由標準曲線上查得的肌酐的濃度（g/L）；f——尿樣稀釋倍數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 反應(yīng)時間的選擇

由圖1可知，吸光度值隨著反應(yīng)時間的延長而升高，約30 min時吸光度值趨于平衡，故選取30 min為最佳反應(yīng)時間。

圖1 反應(yīng)時間對吸光度值的影響

3.2 反應(yīng)溫度的選擇

由圖2可知，在15℃～40℃之間，吸光度值隨著反應(yīng)溫度的升高而升高，溫度超過40℃時，吸光度值隨著反應(yīng)溫度的升高而降低，原因可能是溫度過高時，苦味酸和肌酐的結(jié)合不穩(wěn)定。在15℃～25℃之間，顯色穩(wěn)定，故選取20℃為最佳反應(yīng)溫度。

圖2 反應(yīng)溫度對吸光度值的影響

3.3 苦味酸加入量的選擇

由圖3可知，吸光度值隨著苦味酸加入量的增加而升高，在苦味酸加入量為2.0 mL時，吸光度值趨于平衡。苦味酸加入量在1.5～3.0 mL時，標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)較好。苦味酸加入量在1.5 mL時，標準曲線斜率較小，較為平緩；苦味酸加入量2.0 mL與2.5 mL、3.0 mL相比，標準曲線斜率相差不大，故選取苦味酸加入量為2.0 mL。

圖3 苦味酸對吸光度值的影響

3.4 尿中肌酐檢測條件優(yōu)化

反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和苦味酸加入量的正交試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理結(jié)果見表3。

表3 正交試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理結(jié)果

由表3可知，影響尿中肌酐測定的主要因素主次順序為C＞A＞B，即苦味酸加入量對尿中肌酐測定的影響最大，反應(yīng)溫度影響最小。最優(yōu)化工藝組合條件為A2（A3）B3C3，即反應(yīng)時間30 min（35min）、反應(yīng)溫度25℃、苦味酸加入量2.5 mL。由于試驗中反應(yīng)溫度的影響最小，綜合經(jīng)濟性和實際條件考慮，選取反應(yīng)時間30 min、反應(yīng)溫度20℃、苦味酸加入量2.0 mL為最佳反應(yīng)條件，此條件下制作的標準曲線見圖4。

圖4 不同苦味酸加入量標準曲線圖

3.5 方法學考察

3.5.1 檢出限

加入一定體積的0.10 g/L肌酐標準溶液，扣除空白值后，將吸光度為0.015所對應(yīng)的濃度作為檢出限，經(jīng)換算得出該方法的檢出限為0.01 g/L（取樣體積為0.10 mL），結(jié)果見表4。

表4 檢出限試驗

3.5.2 方法精密度

取0.1 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L這3個濃度水平的樣品，重復測定10次，相對標準偏差為0.85%～2.98%。結(jié)果見表5。

表5 精密度試驗（n=10）

3.5.3 加標回收試驗

由表6可知，低點加標的平均回收率為101.7%；中點加標的平均回收率為97.8%；高點加標的平均回收率為100.6%。可見低、中、高點的加標回收率均在95%～105%之間。

表6 加標回收率試驗

4 結(jié)論

綜上所述，苦味酸法檢測尿中肌酐的最優(yōu)條件為：加入苦味酸2.0 mL，定容后在20℃反應(yīng)30 min；以零管為參比，采用5 mm比色皿，于波長490 nn下測定。結(jié)果顯示，尿肌酐在0.1 g/L～3.0 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，檢出限為0.01 g/L，RSD為0.85%～2.98%，加標回收率在95%～105%，表明該方法準確可靠。與WS/T 97-1996《尿中肌酐分光光度測定方法》相比，降低了檢出限，擴展了檢測范圍，提升了檢測質(zhì)量和檢測效率，可為標準方法的更新提供參考依據(jù)。