林雙慶 王仍瑞 許秋貝 鄭小文 楊玉貞

（廈門海關(guān)技術(shù)中心 福建 廈門 361000）

1 前言

實驗室間比對是指按照預(yù)先規(guī)定的條件，由多個實驗室對相同或類似的樣本進行檢測的組織、實施和評價[1]，可作為能力驗證的補充，強化實驗室質(zhì)量控制，是多種外部質(zhì)量控制的方法之一。漳州市是福建省出口食品農(nóng)產(chǎn)品的重要城市，2015年其食品農(nóng)產(chǎn)品出口量居全國地級市首位[2]。本次實驗室間比對評價了漳州地區(qū)以出口為主的63家食品企業(yè)的微生物檢測能力，以幫助企業(yè)內(nèi)部實驗室查找日常檢測工作中存在的問題，制定相應(yīng)措施以保持或提升其微生物檢測能力。本次實驗室間比對共涉及6個微生物檢測項目，2個定量項目包括菌落總數(shù)和大腸菌群，4個定性項目包括金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌和單核細胞增生李斯特菌。

2 材料與方法

2.1 主要儀器與試劑

恒溫培養(yǎng)箱（F-0.5P，日本醫(yī)化儀器公司）；全自動微生物鑒定儀（VITEK2 Compact 30，法國生物梅里埃公司）；生物安全柜（HF1200，上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；冷凍干燥機（LFD5508，韓國DAIHAN LABTECH公司）；高壓滅菌鍋（VB-95，德國SYSTEC公司）；TSA固體培養(yǎng)基、BHI液體培養(yǎng)基、BPW液體培養(yǎng)基，APW液體培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；NaN3、海藻糖、谷氨酸鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；0.85%無菌生理鹽水（實驗室自制）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）；金黃色葡萄球菌（ATCC6538）；表皮葡萄球菌（CMCC26069）；副溶血性弧菌（ATCC17802）；單核細胞增生李斯特氏菌（ATCC19115）；英諾克李斯特氏菌（ATCC33090）；大腸埃希氏菌（ATCC25922）；陰溝腸桿菌（CICC 21539）。菌株均來自專業(yè)機構(gòu)保存的可溯源標(biāo)準(zhǔn)菌株。

2.3 方案設(shè)計

按參試實驗室所報項目發(fā)放樣品，定量項目隨機發(fā)放1份考核樣品，定性項目隨機發(fā)送2份考核樣品（陰性樣本或陽性樣本），每份樣品對應(yīng)1個唯一編號。參試實驗室按《乳粉中微生物項目比對實驗參試指導(dǎo)書》進行樣品接收、檢測和結(jié)果報送。方案同時賦予每個實驗室1個代碼，結(jié)果分析和能力評價均以實驗室代碼表示。

2.4 樣品制備

將標(biāo)準(zhǔn)菌株在BHI液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇，增菌備用（副溶血性弧菌在APW液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇）；在含有保護劑的乳粉基質(zhì)中添加預(yù)定濃度的目標(biāo)菌懸液（部分項目添加背景干擾菌），充分混勻，裝入西林瓶，冷凍干燥后完成制備。

菌株添加前需進行菌株純度和關(guān)鍵生化特性驗證；基質(zhì)、保護劑和西林瓶等樣品制備所需試劑耗材需經(jīng)無菌處理，并在無菌環(huán)境中完成樣品制備；致病菌樣品在相應(yīng)的生物安全等級區(qū)域完成制備。

2.5 檢測方法

建議檢測方法為GB4789系列國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)[3-8]。

2.6 均勻性和穩(wěn)定性檢驗

樣品均勻性檢驗方法：樣品分裝后，隨機抽取10份樣品，每份樣品重復(fù)測試2次，定性樣品的測試結(jié)果均與樣品指定值（陽性或陰性）一致時，說明該樣品符合要求。定量樣品依據(jù)CNAS-GL003：2018《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》中的單因子方差分析法（F檢驗法）進行均勻性檢驗[9]。

樣品穩(wěn)定性檢驗方法：（1）在貯存溫度（4℃）下，于均勻性檢驗完成后的第10、20天，隨機抽取3個樣品進行檢測；（2）在模擬樣品的運輸條件下（2天時間內(nèi)樣品可送達各實驗室），將樣品分別置于20℃、36℃和42℃環(huán)境條件下，于均勻性檢驗完成后的第3、6天，隨機抽取3個樣品檢測。每個樣品重復(fù)測試2次。定性樣品的測試結(jié)果與樣品指定值（陽性或陰性）均一致時，說明該樣品符合要求。將定量樣品的測試結(jié)果與均勻性檢測數(shù)據(jù)進行比較，采用T檢驗法（依據(jù)CNAS-GL003：2018“5.2”中的內(nèi)容）進行穩(wěn)定性評價。均勻性和穩(wěn)定性檢驗結(jié)果表明，樣品之間不存在顯著性差異，滿足實驗室間比對樣品要求。

2.7 統(tǒng)計分析的設(shè)計和結(jié)果評價原則

定性項目：將參試實驗室的檢測結(jié)果與實驗設(shè)計的指定值（陽性或陰性）進行比較，若兩者結(jié)果一致，能力評價為“滿意”；若結(jié)果不一致，能力評價為“不滿意”。定量項目：參照CNAS-GL002《能力驗證結(jié)果的統(tǒng)計處理和能力評價指南》和CNAS-CL01-A001《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明》的穩(wěn)健統(tǒng)計方法，確定指定值X和能力評定標(biāo)準(zhǔn)差σ[10-11]，計算Z比分?jǐn)?shù)（Z值），利用Z值進行結(jié)果評價。當(dāng)｜Z｜≤2.0時，結(jié)果為“滿意”；當(dāng)2.0＜｜Z｜＜3.0時，結(jié)果為“可疑”；當(dāng)｜Z｜≥3.0時，結(jié)果為“不滿意”。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢測結(jié)果總體情況分析

本次實驗共有65家實驗室參與，收回368個實驗結(jié)果。菌落總數(shù)項目共有63家實驗室參加并報送結(jié)果，各反饋結(jié)果的實驗室Z比分?jǐn)?shù)見圖1。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，共有52家結(jié)果為“滿意”，占比82.5%；5家結(jié)果為“可疑”，占比7.9%；6家結(jié)果為“不滿意”，占比9.5%。

圖1 菌落總數(shù)測定結(jié)果Z比分?jǐn)?shù)分布柱狀圖

大腸菌群項目共有63家實驗室參與，有5家結(jié)果無具體數(shù)值（大于或小于某個數(shù)值），未參與統(tǒng)計分析和結(jié)果評價，各反饋結(jié)果的實驗室Z比分?jǐn)?shù)見圖2。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，共43家結(jié)果為“滿意”滿意，占比74.1%；8家結(jié)果為“可疑”，占比13.8%；7家結(jié)果為“不滿意”，占比12.1%。

圖2 大腸菌群測定結(jié)果Z比分?jǐn)?shù)分布柱狀圖

2個定量項目的檢測結(jié)果見表1。

表1 2個定量項目結(jié)果滿意的實驗室家數(shù)及百分比

金黃色葡萄球菌項目共有43家實驗室參與，收回86個結(jié)果，41家實驗室結(jié)果為“滿意”，占比95.3%；2家結(jié)果為“不滿意”，占比4.7%。

沙門氏菌項目共有38家實驗室參與，收回76個結(jié)果，37家實驗室結(jié)果為“滿意”，占比97.4%；1家結(jié)果為“不滿意”，占比2.6%。

副溶血性弧菌項目共有22家實驗室參與，收回44個結(jié)果；單核細胞增生李斯特氏菌項目共有18家實驗室參與，收回36個結(jié)果，均未出現(xiàn)不滿意結(jié)果。

4個定性項目檢測結(jié)果見表2。

表2 4個定性項目結(jié)果滿意的實驗室家數(shù)及百分比

3.2 檢測方法情況

除1家實驗室的副溶血性弧菌項目采用SN/T 0173行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)外，其他實驗室和其他項目均使用GB 4789系列國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)進行檢測。

3.3 不滿意結(jié)果分析

對本次實驗反饋的結(jié)果進行分析，部分實驗室出現(xiàn)可疑或不滿意結(jié)果的原因可能為：

（1）樣品處理不合理。未嚴(yán)格按照參試指導(dǎo)書制備樣品，例如，未充分洗脫西林瓶內(nèi)的樣品或使其出現(xiàn)溢灑；分割一部分樣品進行檢測；樣品溶解不充分，導(dǎo)致樣品菌數(shù)發(fā)生變化。

（2）檢驗人員經(jīng)驗不足。有5家實驗室未能給出大腸菌群MPN計數(shù)法檢測結(jié)果的具體數(shù)值，說明其未能充分評估樣品中的大腸菌群含量，未選擇合適的稀釋梯度進行實驗。若實驗過程中出現(xiàn)未對樣品充分混勻、移液器使用不規(guī)范、培養(yǎng)基溫度過高等情況，也會影響檢測結(jié)果。

（3）檢測方法使用不當(dāng)。部分實驗室未能使用現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)，如代碼P7實驗室采用已廢止的標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2-2010和GB 4789.3-2010，代碼P11實驗室采用的SN/T 0173-2010由SN/T 0173-2018替代[12]。

（4）出現(xiàn)假陰性結(jié)果可能原因：培養(yǎng)基質(zhì)量不能滿足實驗要求，未分離出典型菌落；進行生化實驗時，未使用標(biāo)準(zhǔn)菌株作陰陽性對照；僅挑取1～2個可疑菌落進行生化實驗，結(jié)果為假陰性時直接判定結(jié)果。

（5）出現(xiàn)假陽性結(jié)果可能原因：在同時檢測2份樣品的過程中，發(fā)生了交叉污染，陰性樣品受陽性樣品污染，出現(xiàn)假陽性結(jié)果；培養(yǎng)基出現(xiàn)典型或可疑菌落后，未按要求進行生化和血清驗證就判定為陽性結(jié)果。

4 討論

本次實驗室間比對實驗定量項目結(jié)果的滿意率較低，菌落總數(shù)為82.5%，大腸菌群為74.1%；定性項目結(jié)果的滿意率較高，4個項目均達到90%以上。影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的因素有檢測人員、儀器設(shè)備、樣品處理、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、檢測方法、設(shè)施與環(huán)境條件、試劑材料等[13]，在檢測過程中應(yīng)對這些因素進行合理有效的控制。結(jié)果為“不滿意”的實驗室應(yīng)當(dāng)增加相關(guān)項目的外部質(zhì)控活動頻次，及時發(fā)現(xiàn)不足和積累經(jīng)驗，不斷提升自身檢測業(yè)務(wù)能力，有效控制食品安全風(fēng)險，確保檢測質(zhì)量符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求。