朱澤兵 袁林 張德偉

（重慶市萬州食品藥品檢驗所/三峽庫區(qū)道地藥材開發(fā)利用重慶市重點實驗室 重慶 404000）

1 前言

小兒柴桂退熱顆粒由柴胡、桂枝、葛根、黃芩、白芍等7味藥材組成，收載于《中國藥典》2020年版一部，具有發(fā)汗解表、清里退熱的功效，常用于治療小兒外感發(fā)熱[1]，或與其他藥品聯(lián)用治療小兒呼吸系統(tǒng)疾病[2-4]?，F(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對葛根中的葛根素進行定量分析，其余成分均采用薄層色譜進行定性鑒別，不利于其質(zhì)量控制。劉昌孝院士[5-10]提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker）概念，指出客觀評價中成藥的質(zhì)量是非常重要的[11-17]，當(dāng)前，相關(guān)研究大多采用一側(cè)多評、指紋圖譜、特征圖譜、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀等測定中成藥的成分[18-20]。本文采用超高效液相色譜法多波長同時測定樣品中多組分技術(shù)，測定小兒柴桂退熱顆粒12中成分的含量，以期為相關(guān)人員提供參考。

2 儀器與材料

2.1 儀器

超高液相色譜儀（LC-30A，配二極管陣列檢測器（RF-20AXS），日本島津公司）；Accucore aQ C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，2.6 μm）；十萬分之一天平，萬分之一天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；超聲波提取儀（昆山市超聲儀器有限公司）；超純水機（重慶市科潤水處理設(shè)備有限公司）。

2.2 試藥

小兒柴桂退熱顆粒（批號：20201177、20191012，貴州百靈企業(yè)集團制藥股份有限公司）（批號：20210105，葵花藥業(yè)集團（襄陽）隆中有限公司）；桂皮醛（批號：110710-2019022，含量：99.5%）；葛根素（批號：110752-201916，含量95.4%）；黃芩苷（批號：110715-201921，含量95.4%）；芍藥苷（批號：110736-201935）；漢黃芩素（批號：111514-201812，含量100.0%）；漢黃芩苷（批號：112002-201802，含量98.5%）；黃芩素（批號：111595-202108，含量97.9%）；大豆素（批號：100398-201501，含量96.2%）；大豆苷（批號：111738-202004，含量93.4%）；柴胡皂苷a（批號：110777-202012，含量94.8%）；柴胡皂苷d（批號：110778-202112，含量96.3%含量）（中國食品藥品檢定研究院）；葛根素-7-木糖苷（批號：BWB51132，含量91.7%，來源北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）；乙腈（色譜純，美國默克公司）；乙酸銨（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司）；其余試劑為分析純。

3 方法與結(jié)果

3.1 UPLC檢測條件

流動相：乙腈為流動相A，水（含5mmoL/L乙酸銨）為流動相B；梯度洗脫：0～5 min，8%A；5～10 min，8%→20%A；10～20 min，20%→35%A；20～25 min，35%→58%A；25～30 min，8%A；流速：0.3 mL/min；進樣量：2μL；柱溫：30℃。

檢測波長：桂皮醛、黃芩苷、漢黃芩素、漢黃芩苷、黃芩素（280 nm）；芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d（210 nm）；葛根素、大豆素、大豆苷、葛根素-7-木糖苷（250 nm）。

3.2 溶液制備

3.2.1 供試品溶液制備

取本品適量，研細；精密稱取2 g，置于具塞錐形瓶中；加入70%乙醇100 mL，稱定重量；超聲提取30 min，再次稱定重量；用70%乙醇補足減失的重量，濾過；精密量取1 mL，置于100 mL量瓶中；加入70%乙醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜，即得。

3.2.2 混合對照品溶液制備

精密稱取桂皮醛、葛根素、黃芩苷、芍藥苷、漢黃芩素、漢黃芩苷、黃芩素、大豆素、大豆苷、葛根素-7-木糖苷、柴胡皂苷a與柴胡皂苷d對照品適量，置于量瓶中；加入70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

陰性樣品溶液：按處方比例及制備工藝，分別制備缺桂枝、柴胡、葛根、黃芩、白芍藥材的陰性模擬制劑，同時按“3.2.1”項的制備方法制成陰性樣品溶液。

3.3 專屬性試驗

分別精密吸取對照品溶液、空白溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各5 μL，按“3.2.1”項的條件進行測定，結(jié)果見圖1，可見陰性樣品溶液無相應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)。

圖1 12種成分液相色譜圖

3.4 檢出限和定量限

精密量取“3.2.2”項的混合對照品溶液，用70%乙醇不斷稀釋已知濃度的對照品溶液，按“3.2.1”項的條件進樣分析，記錄色譜圖，以信噪比為3∶1和10∶1，分別計算檢出限和定量限，結(jié)果見表1。

3.5 線性關(guān)系的考察

用70%乙醇將對照品儲備液逐級稀釋，配制成不同濃度的混合對照品工作溶液，在按“3.2.1”項的條件進樣分析，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行線性回歸。結(jié)果表明，12種成分在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其線性關(guān)系符合要求，詳見表1。

表1 各成分線性關(guān)系、檢出限和定量限

3.6 精密度試驗

取批號為20210105的樣品，按“3.2.1”項的方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，各成分峰面積RSD為0.59%～2.06%，均＜3%，表明該方法的精密度符合要求，詳見表2。

3.7 穩(wěn)定性試驗

取批號為20210105的樣品，按“3.2.1”項的方法制備供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h，按“3.1”項的條件進行測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，各成分峰面積RSD為0.73%～2.19%，均＜3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，詳見表2。

3.8 重復(fù)性試驗

取批號為20210105的樣品，按“3.2.1”項的方法制備供試品溶液6份，按“3.1”項的條件測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，各成分峰面積RSD為0.58%～1.75%，均＜3%，表明本方法的重復(fù)性符合要求，詳見表2。

3.9 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：20210105），研細，取約1 g，精密稱定6份，置于具塞錐形瓶中，分別加入對照品儲備溶液適量，按“3.2.1”項的方法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率。結(jié)果顯示，12種成分的加樣回收率為94.86%～104.91%，RSD值為1.29%～2.94%，詳見表2。

表2 12種成分方法學(xué)結(jié)果（n=6）

3.10 樣品含量測定

本文選取3批樣品，每批精密稱取2 g，平行2份，按“3.2.1”制備方法制成供試品溶液，進行測定，計算12種成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 12種成分含量（n=2，mg/g）

4 討論

4.1 提取方法的考察

本文參照《中國藥典》2020年版一部中小兒柴桂退熱顆粒“含量測定”中的條件[1]，對不同提取溶劑進行比較，如甲醇、0.1%甲酸的甲醇溶液、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、0.1%甲酸的乙醇溶液；對不同超聲時間進行比較，如15、30、60、90 min。實驗結(jié)果表明，不同提取溶劑和時間對各成分的含量影響非常大，最終確定“3.2.1”項的供試品溶液制備方法為最優(yōu)方法。

4.2 色譜條件的考察

本文考察了甲醇—乙酸水溶液、甲醇—乙酸銨水溶液，乙腈—乙酸銨水溶液，乙腈—乙酸銨水溶液體系，加梯度洗脫更有利于多種成分的分離，且各成分的靈敏度也能達到檢測的要求，最終確定了“3.1”項的色譜條件為最優(yōu)方法。

4.3 檢測波長選擇

桂皮醛的最大吸收波長為290 nm；黃芩苷、漢黃芩素、漢黃芩苷、黃芩素的最大吸收波長為280 nm；芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的最大吸收波長為210 nm；葛根素、大豆素、大豆苷、葛根素-7-木糖苷的最大吸收波長為250 nm，故對這12種成分不能以單一波長進行紫外檢測。使用二極管陣列檢測器（RF-20A），在203 nm～800 nm進行全掃描發(fā)現(xiàn)，桂皮醛在280 nm也有較強吸收，故本文選取3個波長進行檢測。實驗結(jié)果表明，該方法快速高效、靈敏度高、專屬性好，可用于小兒柴桂退熱顆粒中多成分含量的測定。