金雅慧 宋謝清 秦麗 程靜雯 李阿根*

（1.杭州市余杭區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測站 浙江 杭州 311100；2.寧波工程學(xué)院奉化研究院；3.杭州市余杭區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)與植物保護服務(wù)站）

1 前言

桑椹，又稱桑果、桑實、桑棗等[1]，為?？浦参锷＃∕orus alba L.）的干燥果實，含有豐富的維生素、氨基酸和礦物質(zhì)[2]，具有增強抵抗力、降血脂、降血糖、調(diào)節(jié)免疫、防癌抗誘變、促進(jìn)造血細(xì)胞生長等作用[3]。果桑菌核病是桑椹生產(chǎn)中的常發(fā)、重要病害，具有減產(chǎn)嚴(yán)重、連年暴發(fā)、不易防治等特點，在桑椹的主要種植區(qū)均有發(fā)生，特別是開花期遇多雨天氣或在栽培設(shè)施高濕環(huán)境下，易誘發(fā)病原菌真菌菌核萌發(fā)、子囊盤抽生[4-5]，使發(fā)病率上升。果桑菌核病已成為制約果桑產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸，目前藥劑防治仍是實際生產(chǎn)中的主要防治措施。腐霉利（Procymidone）是一種高效低毒的內(nèi)吸性殺菌劑，對葡萄孢屬和核盤菌屬真菌防效較好，能防治果樹、蔬菜等作物的灰霉病、菌核病[6]，因其保護效果好、持效期長，在果桑菌核病防治中得到廣泛應(yīng)用[4-5]。

測量不確定度是對測量結(jié)果可疑程度的定量表述，用于評價檢測過程中各因素對測量結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，為確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確性，須進(jìn)行測量不確定度的評定[7-8]。本文按照NY/T 761-2008[9]標(biāo)準(zhǔn)中第2部分的方法一進(jìn)行檢測，不確定度評估過程參照J(rèn)JF 1135-2005化學(xué)分析測量不確定度評定[10]、JJF 1059.1-2012測量不確定度評定與表示[11]，分析、評定腐霉利檢測過程中的各不確定度分量來源及影響因素，以期為相關(guān)人員測定桑椹中其他擬除蟲菊酯類、有機氯類農(nóng)藥殘留量不確定度評定提供參考。

2 材料和方法

2.1 材料和試劑

正己烷、丙酮、乙腈、氯化鈉（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；弗羅里矽固相萃取小柱（規(guī)格1 000 mg/6 mL，上海安譜實驗科技股份有限公司）；濾膜（規(guī)格0.22 μm，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）；腐霉利標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所）。

2.2 儀器和設(shè)備

食品加工器（K600，德國博朗公司）；電子天平（PL202-L，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司）；氮吹儀（N-EVAP-12，美國Organomation公司）；漩渦混合器（MS3，德國IKA公司）；氣相色譜儀（6890A，配ECD檢測器，美國Agilent公司）；毛細(xì)管柱（HP-5型，30 m×0.32 mm×0.25 μm，美國Agilent公司）。

2.3 實驗方法

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確移取0.5 mL腐霉利標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 μg/mL），置于50 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確移取0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于50 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，搖勻，得到0.1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3.2 氣相色譜儀參考條件

進(jìn)樣口溫度：270℃；檢測器溫度：320℃；不分流進(jìn)樣；載氣：高純氮氣（純度99.99%），恒流模式流速1.0 mL/min；尾吹60 mL/min；柱溫：70℃（保持1 min），以20℃/min升溫至270℃（保持1 min），以1℃/min升溫至285℃（保持5 min）；進(jìn)樣體積：1.0 μL。

2.3.3 樣品前處理

稱取桑椹樣品25 g，加入乙腈50 mL；經(jīng)組織勻漿機勻漿后，收集濾液；置于盛有7 g氯化鈉的具塞量筒中，劇烈震蕩后靜置；從具塞量筒中吸取10 mL上清液，經(jīng)氮吹儀吹至近干；加入2 mL正己烷，將弗羅里矽固相萃取小柱依次用5.0 mL丙酮+正已烷（10+90）、5 mL正已烷預(yù)淋、條件化；待溶劑液面到達(dá)固相萃取小柱吸附層表時，倒入上述2 mL待凈化溶液；用5 mL丙酮+正已烷（10+90）淋洗固相萃取小柱，并重復(fù)1次；將盛有淋洗液的刻度離心管經(jīng)氮吹儀吹至小于5 mL，用正已烷準(zhǔn)確定容至5 mL；經(jīng)旋渦混合器混勻后，過0.22 μm濾膜至樣品瓶中，以供測定。

2.3.4 數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)檢測方法，建立桑椹樣品中霉利殘留量的數(shù)學(xué)模型：

式中：ω——桑椹中腐霉利的殘留量（mg/kg）；Va——提取溶劑總體積 （mL）；Vb——吸取上清液體積（mL）；Vc——樣品溶液定容體積（mL）；cref——標(biāo)準(zhǔn)溶液中腐霉利濃度（μg/mL）；A——樣品溶液中農(nóng)藥腐霉利峰面積平均值；As——標(biāo)準(zhǔn)溶液中農(nóng)藥腐霉利峰面積平均值；m——樣品的質(zhì)量（g）；R——樣品加標(biāo)回收率（%）；fr——樣品均勻性校正因子，1。

3 結(jié)果和分析

3.1 不確定度的來源分析

根據(jù)數(shù)學(xué)模型及樣品測定過程進(jìn)行分析，影響桑椹中腐霉利測定結(jié)果的不確定度來源主要為：檢測方法總重復(fù)性；標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程；樣品稱量；樣品前處理過程中的樣品提取液體積、吸取上清液體積、樣品溶液定容體積；樣品的回收率；樣品均勻性校正因子；氣相色譜儀峰面積測量。

由于數(shù)學(xué)模型為乘除形式，可采用相對不確定度評定，且無需計算靈敏度系數(shù)，故桑椹樣品中腐霉利殘留量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成公式為：

式中：u（rep）——峰面積A、As、移液、定容及稱量等操作的重復(fù)性分量，合并而成的一個總實驗的分量，利用ω重復(fù)測量數(shù)據(jù)計算的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3.2 不確定度分量評定

3.2.1 檢測方法總重復(fù)性引入相對不確定度urel（rep）

分別稱取10份樣品，按“2.1”測量中的方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

表1 重復(fù)測定檢測結(jié)果

根據(jù)貝塞爾公式計算標(biāo)準(zhǔn)偏差：

實際測量時，一般對樣品測定2次，以確定測量結(jié)果：

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入相對不確定度urel（crep）

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制測量模型為：

式中：cs——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度（1 000 μg/mL）；V1——移液管移取的標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（0.5 mL）；V2——定容時單標(biāo)線容量瓶體積（50 mL）；V3——移液管移取的標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋后體積（0.5 mL）；V4——再次定容時單標(biāo)線容量瓶體積（50 mL）。

3.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度cs引入的相對不確定度urel（cs）

使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，腐霉利質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)值為1 000 μg/mL，其標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供的不確定度為3%，即±30 μg/mL，指明包含因子k=2，則由腐霉利標(biāo)準(zhǔn)品本身濃度引入相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中由量具、溶劑膨脹引入相對不確定度urel（Vi）（i=1～4）

JJG 196-2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[12]規(guī)定：20℃時，1 mL分度移液管的最大允許誤差MPE為±0.008 mL，根據(jù)均勻分布，k=。50 mL單標(biāo)線容量瓶的MPE為±0.05 mL，根據(jù)三角分布，k=。實驗室溫度為（20±5）℃，正己烷體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3/℃，由此產(chǎn)生的體積變化根據(jù)均勻分布，k=。

3.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入相對不確定度urel（crep）

3.2.3 樣品稱量引入相對不確定度urel（m）

查閱檢定證書，樣品稱量所用電子天平的MPE為±0.05 g，根據(jù)均勻分布：

3.2.4 樣品前處理過程中樣品提取液體積、吸取上清液體積、樣品溶液定容體積引入相對不確定度urel（Va）、urel（Vb）、urel（Vc）

JJG 196-2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[12]規(guī)定，20℃時，50 mL量筒的MPE為±0.25 mL；10 mL分度移液管的MPE為±0.05 mL；5 mL刻度離心管的MPE為±0.1 mL，根據(jù)按均勻分布，k=。實驗室溫度為（20±5）℃，乙腈、正己烷的體積膨脹系數(shù)分別為1.37×10-3/℃、1.37×10-3/℃，由此產(chǎn)生的體積變化根據(jù)均勻分布，k=。

3.2.5 方法回收率引入相對不確定度urel（R）

對5份陰性桑椹樣品進(jìn)行腐霉利加標(biāo)實驗（添加濃度0.010 mg/kg），回收率分別為105.3%、96.6%、94.0%、96.0%、101.6%，平均回收率為98.7%。

回收率引入的不確定度采用A類評定中的極差法進(jìn)行評定：

平均回收率要進(jìn)行t顯著性檢驗：

說明回收率R不必在測量模型中采用修正測定結(jié)果，但其對不確定度的貢獻(xiàn)須考慮。

3.2.6 樣品的均勻性校正因子fr引入的相對不確定度urel（fr）

根據(jù)檢測方法，平行配制3份樣品，采用氣相色譜儀分別進(jìn)行測定，其數(shù)據(jù)為：0.906 mg/kg、0.915 mg/kg、0.912 mg/kg，據(jù)JJF 1059.1-2012測量不確定度評定與表示[11]，極差系數(shù)C為1.69。

以2次測量平均值為其測量結(jié)果：

3.2.7 色譜儀峰面積測量值引入的相對不確定度urel（A）

3.2.7.1 氣相色譜儀進(jìn)樣體積引入的相對不確定度urel（Ve）

氣相色譜儀進(jìn)樣器配備10 μL微量注射器進(jìn)樣，其使用說明書標(biāo)明定量重復(fù)性為1.0%，即其重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差：

3.2.7.2 氣相色譜儀檢測器引入的相對不確定度urel（A1）

氣相色譜儀檢定證書標(biāo)明其定量重復(fù)性為1.3%，即其區(qū)間半寬度為0.013，根據(jù)矩形分布，k=，則可得相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.2.7.3 色譜儀峰面積測量值引入的相對不確定度urel（A）

3.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由上述計算得到的各分量相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果見表2，合成桑椹樣品中腐霉利殘留量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表2 測定過程中各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量統(tǒng)計結(jié)果

已知2次測定值的平均值為0.353 mg/kg：

3.4 擴展不確定度和結(jié)果表示

取包含因子k=2，按95%置信概率，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度與包含因子相乘，計算得到測量結(jié)果的擴展不確定度為：

U=k×u（ω）＝2×0.01271＝0.02542≈0.025（mg/kg）

當(dāng)測得桑椹中腐霉利殘留量為ω'=0.353mg/kg時，其測量結(jié)果為：

ω=ω'±U=（0.353±0.025），k=2

4 結(jié)論

本文按照NY/T 761-2008[9]標(biāo)準(zhǔn)中第2部分的方法一，采用氣相色譜法測定桑椹中腐霉利的殘留量，根據(jù)數(shù)學(xué)模型及樣品測定過程，分析、評定各不確定度分量，結(jié)果顯示，各分量中方法回收率和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制對總相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度貢獻(xiàn)率分別為37.0%、35.0%，對檢測結(jié)果影響較大。在實際檢測過程中，應(yīng)加強實驗室質(zhì)量管理，通過技術(shù)培訓(xùn)、人員比對、制定SOP操作手冊等，不斷提升檢測水平和操作規(guī)范性，并對儀器設(shè)備進(jìn)行定期校準(zhǔn)和維護，做好環(huán)境條件控制，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。