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        海欖雌根多糖提取及其抗氧化活性研究

        2022-08-02 05:20:56陳吳海曹雯婷李興隆葉劍芝趙來(lái)金
        現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 2022年14期
        關(guān)鍵詞:超純水光度試劑

        陳吳海 曹雯婷 李興隆 葉劍芝 李 培 趙來(lái)金

        (1 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,廣東湛江 524001;2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院,云南普洱 665099)

        海欖雌(Avicennia marina(Forsk.) Vierh.),又名白骨壤、海豆,為馬鞭草科灌木植物,在我國(guó)常分布于臺(tái)灣、福建和廣東。主要生長(zhǎng)于海邊和海岸鹽沼潮濕濕潤(rùn)地帶,通常為組成海岸植物紅樹林的種類之一。海欖雌紅樹林野生植物群落擁有巨大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)價(jià)值,在防護(hù)海岸堤壩、防風(fēng)防浪、促淤固岸、調(diào)控海岸生態(tài)平衡等方面發(fā)揮著重要作用[1]。 海欖雌是耐淹水和耐鹽能力很強(qiáng)的紅樹植物,其葉和果實(shí)經(jīng)過(guò)鹽水浸泡或用鹽水處理去澀后不僅可爆炒食用或水煮食用,也可用作一些動(dòng)物的飼料。據(jù)相關(guān)研究,海欖雌富含可產(chǎn)生抗生素、防腐劑和酶等活性物質(zhì)的內(nèi)生菌且部分菌株具有廣譜抑菌活性,可作為開發(fā)新型生物活性化合物的重要來(lái)源[2]。

        海欖雌作為藥用植物資源,可用于治療瘧疾、風(fēng)濕、哮喘、天花和潰瘍等多種疾病,具有改善癌癥、腹瀉、炎癥、糖尿病及氧化應(yīng)激等疾病的藥物特性;此外,還具有抑制植物病原菌[3]、殺蟲[4]及抗衰老[5-6]等功效。然而,目前鮮見紅樹林海欖雌多糖提取及其抗氧化活性研究的報(bào)道,其抗氧化活性方面的用途也未得到充分發(fā)掘。

        自由基是動(dòng)物體代謝的正常產(chǎn)物,動(dòng)物處于正常生理狀態(tài)時(shí),自由基通常保持穩(wěn)態(tài)。當(dāng)動(dòng)物體內(nèi)自由基的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞時(shí),過(guò)量的自由基會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成損傷,危害動(dòng)物健康,甚至引起疾病[7]。研究表明,負(fù)離子病毒抗體能夠有效消減自由基,減緩人體衰老,增強(qiáng)人體免疫力。 因此,研究海欖雌多糖提取工藝及其抗氧化活性,對(duì)促進(jìn)紅樹林微生物資源的開發(fā)和應(yīng)用具有重要意義。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        供試紅樹林海欖雌采于廣東省湛江市。

        試驗(yàn)試劑:分析純濃硫酸,分析純葡萄糖,苯酚,無(wú)水乙醇,丙酮,超純水,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),VC,羥基自由基試劑盒。

        試驗(yàn)儀器:紫外可見分光光度計(jì)(UV752N),由上海佑科儀器儀表有限公司生產(chǎn);電熱恒溫水浴鍋(HH.S11-Nis),由北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠生產(chǎn);高速冷凍離心機(jī)(CG22G111),由日本日立公司生產(chǎn);電熱恒溫干燥箱(Fd115),由德國(guó)BINDER 生產(chǎn);電子天平,由賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司生產(chǎn)。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1樣品粉碎。海欖雌根采后自然曬干,然后放入50 ℃恒溫烘箱中烘干后取出,粉碎至20~40 目,在干燥環(huán)境中保存,備用。

        1.2.2多糖提取。 先用冷水浸泡粉末2 h,然后用10 L 超純水于80 ℃條件下提取2 次,每次2 h:離心(2 000 r/min,10 min),將上清液真空濃縮至100 mL,加入4 倍體積的95%乙醇沉淀[8];離心(2 000 r/min,10 min)收集絮狀物,并用300 mL 超純水復(fù)溶,真空濃縮除去殘余乙醇,殘留液離心(2 000 r/min,10 min)除去不溶物,上清液真空濃縮,冷凍干燥,得粗多糖,稱重,備用。

        1.2.3Sevag 法脫蛋白。首先取氯仿和正丁醇按體積比4∶1 混合配制Sevag 試劑,將冷凍干燥后的海欖雌多糖取出,用適量的超純水將其溶解,將多糖溶液與Sevag 試劑按體積比4∶1 均勻混合[9-10]。靜置一段時(shí)間后出現(xiàn)3 層溶液,由于水比有機(jī)試劑輕,多糖溶于水即多糖溶液會(huì)浮在漏斗的最上層,中層溶液為變性蛋白,下層溶液是有機(jī)溶劑,去除變性蛋白層和有機(jī)溶劑層,重復(fù)上述操作5 次,直到無(wú)白色絮狀物為止,最后一次把混有Sevag 試劑的多糖溶液放在通風(fēng)櫥中靜置過(guò)夜[11]。 脫蛋白之后的多糖溶液在200~400 nm 處進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描,觀察280 nm 處是否有吸收峰,以此來(lái)確定蛋白質(zhì)是否去除干凈。

        1.2.4大孔樹脂脫色。 取70 g 大孔樹脂放入500 mL燒杯中,加95%乙醇浸泡充分膨脹10 h,然后置入有1/3 體積超純水的玻璃柱內(nèi)(40.0 cm×2.7 cm),之后用超純水淋洗至無(wú)明顯乙醇?xì)馕?,再用反沖的辦法排盡樹脂柱內(nèi)的氣泡。 取適量脫蛋白后的多糖溶液,上樣,超純水洗脫,收集多糖溶液,苯酚硫酸法跟蹤多糖是否洗脫完全。合并多糖洗脫液,真空旋蒸濃縮備用。

        1.2.5透析。 將透析袋剪成約15 cm 的長(zhǎng)度后,放入1.0 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉溶液中,煮沸10 min,超純水漂洗干凈,然后用2% NaHCO3溶液煮沸10 min,超純水漂洗,最后在超純水中煮沸10 min。再用超純水漂洗,冷卻后浸入超純水中并在4 ℃冰箱中保存。將多糖溶液裝入透析袋內(nèi),用夾子夾緊袋口,用自來(lái)水透析48 h,透析結(jié)束后,再在超純水中透析過(guò)夜,將多糖溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上真空濃縮,冷凍干燥后備用。

        1.2.6洗滌收集。 按順序用丙酮和無(wú)水乙醇將多糖洗滌3 遍, 然后置于通風(fēng)櫥內(nèi)讓殘余的有機(jī)試劑自然揮發(fā),待有機(jī)試劑揮發(fā)完后,收集多糖固體。

        1.2.7苯酚—硫酸法測(cè)定多糖含量。配制5%苯酚溶液:取苯酚5 g,置于100 mL 容量瓶中,加超純水至刻度,搖勻后,裝入棕色試劑瓶中,置于冰箱中冷藏儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?配制標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖母液:準(zhǔn)確稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg 于25 mL 容量瓶中,加水至刻度,分別吸取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL,并以超純水補(bǔ)至1.0 mL,即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)濃度0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/L。 然后加入5%苯酚1 mL 及濃硫酸5.0 mL,搖勻冷卻。 室溫下放置20 min 后于490 nm 處測(cè)光密度,以1.0 mL 水按同樣顯色操作為空白,以橫坐標(biāo)為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)濃度、縱坐標(biāo)為吸光度,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[12-14]。

        準(zhǔn)確稱取1.0 mg 多糖固體,蒸餾水溶解后定容到10.0 mL 容量瓶中,搖勻,作為多糖儲(chǔ)備液。 然后精確量取多糖儲(chǔ)備液1.0 mL,再用上述方法測(cè)定吸光度,然后根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。 計(jì)算公式如下:

        式中,W為多糖含量(%),m1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得樣品測(cè)定液中含糖量(μg),m2為樣品質(zhì)量(g)。

        1.2.8DPPH 清除試驗(yàn)。 DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼),是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基,其無(wú)水乙醇溶液呈紫色,在517 nm 衍射波段處有最大吸收,吸光度與濃度呈線性關(guān)系[15]。向其中加入自由基清除劑時(shí),可以結(jié)合或替代DPPH,使自由基數(shù)量減少,吸光度變小,溶液顏色變淺,借此可評(píng)價(jià)清除自由基的能力,即通過(guò)在517 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)樣品清除DPPH的效果來(lái)計(jì)算抗氧化能力[16]。

        稱取5 mg DPPH,用95%乙醇溶解并定容于100 mL 容量瓶中備用。配制2 mg/mL 根多糖母液:取母液0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 于6 個(gè)試管中,分別加超純水至1.0 mL。 測(cè)定管:0.5 mL 樣品液+3.5 mL DPPH 液。對(duì)照管:0.5 mL 樣品液+3.5 mL 95%乙醇??瞻捉M:0.5 mL 超純水+3.5 mL DPPH 液。反應(yīng)體系共4.0 mL 溶液,取0.5 mL 樣品液,得粗多糖 終 濃 度 分 別 為0.025、0.050、0.100、0.200、0.500、0.750、1.000 μg/mL。 在黑暗處放置30 min,1 cm 光徑,517 nm,95%乙醇調(diào)零,測(cè)定各管吸光度值。 各管做3 個(gè)平行,取其平均值進(jìn)行計(jì)算。 VC為陽(yáng)性對(duì)照,用超純水溶解,與粗多糖樣品同法制備,按下式計(jì)算樣品對(duì)DPPH 的清除率。

        式中,Ai為測(cè)定管的吸光度,Aj為對(duì)照組的吸光度,A0為空白管的吸光度[17]。

        1.2.9清除羥自由基試驗(yàn)。 H2O2/Fe2+通過(guò)Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基, 將鄰二氮菲-Fe2+水溶液中Fe2+氧化為Fe3+,導(dǎo)致536 nm 吸光度下降,樣品對(duì)536 nm吸光度下降速率的抑制程度能反映樣品清除羥自由基的能力[18]。-OH 是活性氧中最活潑的氧自由基,幾乎能與活細(xì)胞中任何分子發(fā)生反應(yīng),可介導(dǎo)機(jī)體組織脂質(zhì)過(guò)氧化,蛋白質(zhì)解聚、聚合,核酸斷裂和多糖裂解等生化過(guò)程,引發(fā)組織細(xì)胞病變,導(dǎo)致各種疾病發(fā)生和加速機(jī)體衰老。 減少此類自由基, 可預(yù)防衰老、心血管疾病,并具有防癌、抗癌的作用。

        本次羥自由基試驗(yàn)由試劑盒完成。 底物應(yīng)用液和試劑三均從購(gòu)置的試劑盒中直接獲得。 將底物應(yīng)用液和試劑三應(yīng)用液,先在37 ℃水浴中預(yù)溫3 min。試驗(yàn)操作在37 ℃水浴中進(jìn)行。對(duì)照管:0.2 mL 超純水+0.2 mL 底物應(yīng)用液+0.4 mL 試劑三應(yīng)用液。測(cè)定管:0.2 mL 底物應(yīng)用液+0.2 mL 樣品液+0.4 mL 試劑三應(yīng)用液。混勻,37 ℃水浴反應(yīng)1 min,從加完試劑三應(yīng)用液開始到1 min 結(jié)束,立即加入griess 顯色劑2 mL 終止反應(yīng),1 次只能做1 個(gè)試管?;靹?,室溫放置20 min,1 cm 光徑,550 nm,超純水調(diào)零,測(cè)定各管吸光度值。清除率計(jì)算公式如下:

        式中,A0為對(duì)照管吸光度,Ai為測(cè)定管吸光度。

        粗多糖用超純水溶解,制備3.2 mg/mL 的粗多糖母液。 取母液配制成5 個(gè)濃度梯度(0.80、0.40、0.20、0.10、0.05 mg/mL)。反應(yīng)體系共0.8 mL 溶液,取0.2 mL樣品液,即體系中粗多糖濃度依次為0.20、0.10、0.05、0.02、0.01 mg/mL。 各管做3 個(gè)平行,取其平均值進(jìn)行計(jì)算。 VC為陽(yáng)性對(duì)照,用超純水溶解,與粗多糖樣品同法操作。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 線性方程和多糖含量

        用標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)各吸光度值(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程。 由圖1 可知,在0.02~0.10 mg/L 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2為0.998 2。 根據(jù)苯酚硫酸法測(cè)定的海欖雌根多糖含量為59.66%。

        2.2 DPPH 清除試驗(yàn)

        由表1 可知, 海欖雌根多糖具有清除DPPH 自由基的作用,且隨著濃度的增加,對(duì)DPPH 自由基的清除率呈上升趨勢(shì)。 海欖雌根多糖對(duì)DPPH 自由基的清除能力隨著濃度增加而增加。 這對(duì)于海欖雌根多糖藥理活性研究具有參考意義。

        表1 不同濃度海欖雌根多糖DPPH 抑制率

        2.3 羥自由基清除試驗(yàn)

        由表2 可知,海欖雌根多糖及VC均具有清除羥自由基的能力,且在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)清除羥自由基的作用都呈量效關(guān)系。隨著試驗(yàn)樣品濃度的增加,海欖雌根多糖對(duì)羥自由基的清除率呈上升趨勢(shì)。 當(dāng)海欖雌根多糖提取物質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 時(shí),對(duì)羥自由基清除率最高,為74.04%。

        表2 不同濃度海欖雌根多糖羥自由基清除率

        3 結(jié)論

        研究結(jié)果表明,海欖雌根多糖含量為59.66%;海欖雌根多糖能清除DPPH 和羥自由基,隨著試驗(yàn)樣品濃度的增加,清除率呈上升趨勢(shì)。海欖雌根多糖具有一定的抗氧化活性,可為后續(xù)研究提供參考。

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