馬 麗， 喬 軍， 呂春晶， 孫凌俊

(1.遼寧省果樹科學(xué)研究所，遼寧營(yíng)口 115009； 2.遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧營(yíng)口 115009)

葡萄屬于葡萄科(Vitaceae)葡萄屬()多年生植物，是世界上最古老的物種之一，其果實(shí)可用于鮮食、釀酒和制干，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。葡萄在世界果樹生產(chǎn)中占有非常重要的位置，據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)，2018年全世界葡萄栽培面積約為715.8萬hm，總產(chǎn)量約為7 912.6萬t。我國(guó)葡萄栽培面積達(dá)到79.8萬hm，約占全球總面積的11.1%，產(chǎn)量1 349.5萬t，約占全球葡萄總產(chǎn)量的17.1%(http：//www.fao.org/faostat/en/#data)，是世界葡萄的第一生產(chǎn)大國(guó)。就全世界葡萄生產(chǎn)而言，近70%的葡萄用于加工，超30%的葡萄用于鮮食，而我國(guó)則以鮮食為主，占據(jù)70%以上，鮮食葡萄生產(chǎn)是我國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)的主體。

葡萄屬于典型的非呼吸躍變型果實(shí)，果實(shí)軟化發(fā)生時(shí)間比呼吸躍變型果實(shí)要早，且由于其為漿果，果實(shí)皮薄，汁多，在食用、運(yùn)輸貯存過程中易發(fā)生破裂、腐爛等問題，所以就其鮮食品質(zhì)而言，果實(shí)質(zhì)地已經(jīng)成為判斷鮮食葡萄果實(shí)新鮮程度的一個(gè)重要指標(biāo)。不同葡萄品種間果實(shí)質(zhì)地存在較大差異，脆肉型品種一直備受消費(fèi)者關(guān)注，現(xiàn)已成為重要的育種材料及目標(biāo)品種，然而造成不同品種間質(zhì)地差異的機(jī)制還不是很清楚。因此，了解葡萄果實(shí)成熟軟化及不同質(zhì)地形成因素，對(duì)于葡萄綜合品質(zhì)改良及葡萄栽培有著非常重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用脆肉型葡萄品種紅地球(L.)和軟肉型葡萄品種玫瑰香(L.)為試材，2個(gè)品種均定植于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄試驗(yàn)園內(nèi)(41°50′24″N，123°24′41″E)，管理水平一致。鑒于2個(gè)葡萄品種在遼寧省沈陽地區(qū)物候期接近，2018年2個(gè)品種分別于盛花后56 d(轉(zhuǎn)色前)開始采樣，每隔7 d采樣1次，直到果實(shí)成熟。采樣時(shí)間均定在08：00進(jìn)行，采集方式：每個(gè)品種隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)較為一致的6株樹，在植株的不同位置選取20個(gè)果粒作為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)時(shí)期采集3個(gè)重復(fù)，用裝有冰袋的保溫箱迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，每個(gè)重復(fù)樣品隨機(jī)選取5個(gè)果粒，將種子剔除，果實(shí)磨成細(xì)末狀，用錫紙包好，經(jīng)液氮冷凍1 h后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。其他果?shí)放入4 ℃冰箱用于果實(shí)質(zhì)地及內(nèi)含物測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 果實(shí)質(zhì)地相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 葡萄果實(shí)質(zhì)地測(cè)定采用整果穿刺測(cè)試法。穿刺試驗(yàn)使用的是英國(guó)Stable Micro Systems 公司生產(chǎn)的TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，穿刺試驗(yàn)選擇2 mm直徑的P/2針狀探頭，測(cè)試在室溫下進(jìn)行，測(cè)試時(shí)將被測(cè)試的漿果放置在質(zhì)構(gòu)儀載物臺(tái)的中心位置，用手稍稍固定，力量以不壓迫果實(shí)為宜，樣品被穿刺部位為葡萄漿果中部偏上區(qū)域。質(zhì)構(gòu)儀主要參數(shù)設(shè)定為測(cè)前速度為 1 mm/s，貫穿速度為1 mm/s，測(cè)后速度為10 mm/s，穿刺深度設(shè)為7 mm，負(fù)載觸發(fā)力為5 g。參數(shù)設(shè)定時(shí)需要注意，穿刺既要保證一定的穿刺深度，又要避免在穿刺過程中探頭接觸到葡萄種子，影響測(cè)試結(jié)果。質(zhì)地相關(guān)指標(biāo)包括：果皮硬度(PPH)、果皮破裂距離(PB)、果肉硬度(SF)，果皮硬度是從探頭接觸果皮開始，到探頭穿刺果皮瞬間所用的力(g)；果皮破裂距離是從接觸到刺破果皮瞬間探頭下行位移(mm)；果肉硬度是探頭穿刺果肉到測(cè)試結(jié)束所測(cè)感應(yīng)力的平均值(g)。

1.2.2 總糖和總酸含量測(cè)定 葡萄果實(shí)中總糖和總酸含量利用高效液相色譜儀Agilent1260(美國(guó)安捷倫公司)進(jìn)行測(cè)定。吸取擠壓好并混和均勻的葡萄汁，加入超純水定容至10 mL，吸取定容后果汁 2 mL 置于離心管中，12 000 r/min離心10 min。然后吸取上清液和pH值=2.6的磷酸二氫鉀鹽溶液各500 μL至新的2 mL離心管中進(jìn)行總酸的提取，加入等體積的乙腈進(jìn)行總糖的提取，后使用水系微孔濾膜進(jìn)行過濾，過濾后的溶液用于上機(jī)檢測(cè)。

總糖含量測(cè)定使用的是Agilent Zorbax Carbohydrate色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)和示差折光(RID)檢測(cè)器，柱溫為40 ℃，運(yùn)行時(shí)間為15 min；流動(dòng)相體積比為75 ∶25的乙腈和純凈水，流速為 1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

總酸含量測(cè)定使用的是Agilent SB-AQ色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)，G1314B可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(VWD)，參數(shù)為柱溫25 ℃，波長(zhǎng)210 nm，運(yùn)行時(shí)間15 min。流動(dòng)相為體積比為95 ∶5的10 mmol/L磷酸二氫鉀和甲醇溶液，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.3 果膠含量測(cè)定 原果膠和可溶性果膠采用比色法測(cè)定，略有改動(dòng)。具體方法如下：稱取 1.0 g 帶果皮的果肉組織，在液氮保護(hù)下研成勻漿，轉(zhuǎn)到事先裝好25 mL的95%乙醇溶液的50 mL離心管中，沸水加熱30 min，在煮沸的過程中要及時(shí)補(bǔ)加95%乙醇溶液，冷卻至室溫后，需8 000 r/min離心 15 min，去除上清液，再加入95%乙醇溶液，沸水浴加熱，如此反復(fù)3次。然后將沉淀置于20 mL蒸餾水中，50 ℃保溫30 min后，溶解果膠。取出冷卻至室溫，8 000 r/min 離心15 min，再將上清液用蒸餾水定容至100 mL，該液為水溶性果膠；在沉淀中加入25 mL 0.5 mol/L的硫酸溶液，沸水加熱1 h，取出冷卻至室溫，于8 000 r/min離心15 min，上清液用蒸餾水定容至100 mL，該液為原果膠。測(cè)定時(shí)吸取1 mL提取液，加入6 mL濃硫酸，沸水加熱 20 min，冷卻室溫后，加入0.2 mL 1.5 g/L咔唑-乙醇溶液，暗處放置30 min后，測(cè)定反應(yīng)液在530 nm處的吸光度，重復(fù)3次。根據(jù)溶液吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的半乳糖質(zhì)量，計(jì)算果膠含量，以生成的半乳糖醛酸的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示果膠含量。

1.2.4 熒光定量PCR分析 將2個(gè)品種花后56、63、70、84、98 d的果實(shí)樣品進(jìn)行總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄合成后的cDNA稀釋5倍作為候選基因差異表達(dá)分析的模板。實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)在ABI QuantStudio 6 Flex System(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，美國(guó))384 孔儀器上進(jìn)行，使用SYBR? PremixExⅡ(Takara，Madison，WI，美國(guó))制造反應(yīng)混合液。以作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔ計(jì)算差異表達(dá)值，所有樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，RT-PCR引物采用Primer3設(shè)計(jì)，相關(guān)引物信息見表1。

表1 相關(guān)基因RT-PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 果實(shí)發(fā)育過程中果實(shí)質(zhì)地差異變化

葡萄果實(shí)質(zhì)地是評(píng)價(jià)果實(shí)成熟軟化的一項(xiàng)重要依據(jù)，對(duì)紅地球和玫瑰香2個(gè)品種各發(fā)育階段果實(shí)質(zhì)地進(jìn)行測(cè)定，由圖1分析發(fā)現(xiàn)，紅地球和玫瑰香2個(gè)品種果皮硬度在轉(zhuǎn)色期(花后 63 d)之前均保持在較高水平，隨著發(fā)育時(shí)期遞進(jìn)，軟肉玫瑰香在轉(zhuǎn)色期后，果皮硬度迅速下降，直到成熟期達(dá)到最低值，而脆肉紅地球果皮硬度下降時(shí)期較玫瑰香晚，在花后70 d才開始下降。雖然在花后84 d時(shí)，2個(gè)品種果皮硬度接近，但成熟時(shí)紅地球果皮硬度還是遠(yuǎn)高于玫瑰香的果皮硬度。果皮破裂距離可以反映果皮被刺穿時(shí)漿果形變的程度。由圖2可知，2個(gè)品種果皮破裂距離呈相似的增長(zhǎng)趨勢(shì)，轉(zhuǎn)色前期，2個(gè)品種果皮破裂距離都處于較低水平，轉(zhuǎn)色期紅地球和玫瑰香果皮破裂距離比較接近，分別為2.00、2.05 mm，而后隨著果實(shí)成熟，果皮破裂距離迅速增大，成熟期相差較大，分別為3.68、5.13 mm，整個(gè)發(fā)育過程紅地球的果皮破裂距離都明顯低于玫瑰香的果皮破裂距離。由圖3可知，果肉硬度更多反映的是果肉的機(jī)械性能，果實(shí)整個(gè)發(fā)育過程中，2個(gè)品種果肉硬度變化趨勢(shì)與果皮硬度的變化趨勢(shì)相似，即隨著果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育果肉硬度逐漸降低，轉(zhuǎn)色后下降速度迅速增快，近成熟期果肉硬度變化較為平緩，成熟期時(shí)紅地球和玫瑰香果肉硬度分別降到了44.6、26.28 g，并且在每個(gè)發(fā)育階段紅地球的果肉硬度都高于玫瑰香的果肉硬度。

2.2 果實(shí)發(fā)育過程中果實(shí)糖酸含量變化

伴隨著果實(shí)的發(fā)育、成熟軟化，與成熟軟化相關(guān)的內(nèi)含物也發(fā)生了明顯的變化，總糖含量增加，總酸含量降低。由圖4可知，轉(zhuǎn)色前期葡萄果實(shí)內(nèi)總糖含量較低，隨著果實(shí)轉(zhuǎn)色，迅速增加，在果實(shí)成熟時(shí)達(dá)到最高，而后基本保持不變。紅地球在轉(zhuǎn)色后1周總糖含量增加較慢，出現(xiàn)了一個(gè)平臺(tái)期，而后迅速增加，成熟期達(dá)到最高。玫瑰香總糖含量增加比紅地球快，且玫瑰香各個(gè)時(shí)期的總糖含量均明顯高于紅地球。由圖5可知，果實(shí)內(nèi)總酸含量隨著果實(shí)的成熟逐漸降低，紅地球是個(gè)退酸較快的葡萄品種，轉(zhuǎn)色時(shí)總酸含量急劇下降，而后變化較為平緩，但總酸水平也逐漸降低，直到成熟。玫瑰香果實(shí)內(nèi)的總酸含量也隨著果實(shí)成熟軟化逐漸下降，但各時(shí)期含量都高于紅地球。

2.3 果實(shí)發(fā)育過程中果膠含量變化

隨著葡萄果實(shí)的成熟軟化，果實(shí)細(xì)胞壁發(fā)生降解，果實(shí)質(zhì)地發(fā)生了顯著變化，果膠作為細(xì)胞壁基質(zhì)中含量最高的一類大分子物質(zhì)，其組分和含量也發(fā)生了變化。由圖6可知，隨著葡萄果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育，2個(gè)品種原果膠含量逐漸下降，但在整個(gè)發(fā)育階段，紅地球果實(shí)內(nèi)的原果膠含量一直高于玫瑰香。隨著果實(shí)的成熟軟化，原果膠在相關(guān)酶的作用下分解成可溶性果膠含量，可溶性果膠呈逐漸增加趨勢(shì)，且在轉(zhuǎn)色后增加速度較快，與原果膠相反，紅地球果實(shí)內(nèi)的可溶性果膠含量一直低于玫瑰香(圖7)。

2.4 果實(shí)發(fā)育過程中果膠降解酶基因的表達(dá)

由圖8可知，-表達(dá)量在軟肉玫瑰香和脆肉紅地球中均呈先升高后降低的趨勢(shì)。在轉(zhuǎn)色前期，2個(gè)品種的表達(dá)量接近，轉(zhuǎn)色期二者表達(dá)量均迅速增加，此后-在2個(gè)品種中的表達(dá)模式發(fā)生變化。脆肉紅地球中-的表達(dá)量在轉(zhuǎn)色期達(dá)到最高值后逐漸下降，在成熟期達(dá)到最低值，而軟肉玫瑰香中的表達(dá)量在轉(zhuǎn)色后繼續(xù)升高，花后 84 d 略有降低，但都處于較高水平，而在成熟期表達(dá)量才下降到較低水平。在葡萄果實(shí)轉(zhuǎn)色后的各個(gè)時(shí)期，軟肉玫瑰香中-的表達(dá)量一直極顯著高于脆肉紅地球中的表達(dá)量(除花后98 d)。結(jié)果表明，-基因可能在轉(zhuǎn)色后期調(diào)控了葡萄不同質(zhì)地形成。

表達(dá)量在軟肉葡萄玫瑰香轉(zhuǎn)色期即迅速升高，而后持續(xù)較高水平，在花后84 d開始下降，而在脆肉葡萄紅地球中的表達(dá)量在果實(shí)發(fā)育前期一直處于較低水平，花后70 d才開始逐漸升高，花后84 d達(dá)到最高值后又略有下降(圖9)。比較2個(gè)品種各個(gè)時(shí)期的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)色前后表達(dá)量差異極顯著，隨著果實(shí)成熟軟化表達(dá)量差異變小，但仍然是軟肉葡萄玫瑰香中的表達(dá)量明顯高于脆肉葡萄紅地球中的表達(dá)量。結(jié)果說明可能對(duì)葡萄成熟軟化及不同質(zhì)地形成起到一定作用。

表達(dá)量在2個(gè)品種中的變化趨勢(shì)明顯不同，在整個(gè)發(fā)育階段，軟肉葡萄玫瑰香中的表達(dá)量一直處于較高水平，而在脆肉葡萄紅地球中表達(dá)量呈現(xiàn)出先升高后降低再升高的趨勢(shì)，且各個(gè)時(shí)期，在軟肉葡萄玫瑰香中的表達(dá)量一直極顯著高于在脆肉葡萄紅地球中的表達(dá)量(圖10)。結(jié)果表明，很可能調(diào)控了葡萄果實(shí)的成熟軟化及質(zhì)地的形成。

3 結(jié)論與討論

3.1 果膠變化與不同質(zhì)地形成的關(guān)系

果膠是果實(shí)細(xì)胞壁中非常重要的大分子物質(zhì)，其組分和含量對(duì)果實(shí)質(zhì)地都會(huì)產(chǎn)生一定的影響。Dong等以2個(gè)歐洲冬梨品種為試材，對(duì)貯存5個(gè)月后可溶性果膠(WSP)含量和果膠降解酶活性進(jìn)行測(cè)定，得出歐洲梨果實(shí)質(zhì)地與PG、PL、PME、-GAL、-ARF等果膠降解酶高度相關(guān)，WSP含量越高，果實(shí)硬度越低，認(rèn)為果實(shí)中WSP可以通過減少細(xì)胞黏附，使果實(shí)更容易軟化。Yang等發(fā)現(xiàn)沉默基因的番茄果實(shí)中可溶性果膠含量降低，果實(shí)硬度增加，認(rèn)為可溶性果膠含量與番茄果實(shí)硬度密切相關(guān)。管雪強(qiáng)等對(duì)紅地球葡萄進(jìn)行噴鈣處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源鈣可以增加果實(shí)內(nèi)原果膠含量、總果膠含量以及果實(shí)硬度，且發(fā)現(xiàn)果實(shí)硬度與果膠含量呈極顯著正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)脆肉葡萄紅地球中原果膠含量在各時(shí)期都顯著高于軟肉葡萄玫瑰香中的含量，且果皮硬度和果肉硬度與原果膠含量呈極顯著正相關(guān)，這與管雪強(qiáng)等的研究結(jié)果相似，與可溶性果膠含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與Dong等的結(jié)論相似。

3.2 果膠降解酶基因與葡萄不同質(zhì)地形成的關(guān)系

和基因可以降解去甲酯化的果膠，參與果實(shí)成熟軟化過程。Villarreal等研究發(fā)現(xiàn)，可編碼PG酶活性的基因在脆肉草莓中低表達(dá)，而在軟肉草莓中高表達(dá)，而-(缺少PG 5′端 85 bp 而導(dǎo)致編碼無活性的PG酶)基因表達(dá)模式正好相反，在脆肉草莓中高表達(dá)，在軟肉草莓中低表達(dá)。Fabi等研究得出了基因在木瓜果實(shí)成熟軟化中的關(guān)鍵作用。Atkinson等發(fā)現(xiàn)基因可以通過影響細(xì)胞壁降解和降低細(xì)胞間黏稠度來調(diào)控蘋果果實(shí)硬度。也有研究得出不同PG活性造成了葡萄果實(shí)質(zhì)地的差異?；虮徽J(rèn)為是調(diào)節(jié)果實(shí)成熟軟化的一種重要的候選基因。有研究者認(rèn)為草莓果實(shí)成熟軟化與基因有著直接的關(guān)系。Nunan等發(fā)現(xiàn)基因高表達(dá)可以促進(jìn)葡萄果實(shí)軟化。本研究發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)地葡萄果實(shí)的、基因表達(dá)模式相近，隨著果實(shí)成熟表達(dá)量增加，但比較二者表達(dá)量發(fā)現(xiàn)軟肉葡萄玫瑰香中的表達(dá)量高于脆肉葡萄紅地球中的表達(dá)量，這可能是造成不同質(zhì)地果實(shí)形成的關(guān)鍵因素，該結(jié)論與前人的研究結(jié)果相似。

Smith等研究得出-Gal在草莓果實(shí)成熟軟化過程中起到了關(guān)鍵作用。Paniagua等研究發(fā)現(xiàn)，基因在草莓成熟過程中，參與了共價(jià)果膠的溶解過程，降低了果實(shí)硬度，得出的表達(dá)與草莓果實(shí)硬度密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在葡萄果實(shí)成熟軟化早期，軟肉型玫瑰香中-的表達(dá)量迅速升高，且在整個(gè)成熟過程中，軟肉型玫瑰香-的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于脆肉紅地球中的表達(dá)量，結(jié)果表明-對(duì)葡萄果實(shí)質(zhì)地差異形成起到一定作用，與前人的研究結(jié)果相似。