李鴻波， 符俊洪， 馮 磊

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，貴州貴陽 550006； 2.貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴州貴陽 550025)

黏蟲別稱行軍蟲，屬鱗翅目夜蛾科，是我國和其他亞洲國家及澳洲的重大遷飛性害蟲。該蟲的寄主十分廣泛，可危害玉米、水稻、小麥等100多種作物，主要通過幼蟲取食寄主植物的葉片，影響作物的光合作用，從而造成農(nóng)作物減產(chǎn)。上世紀(jì)50—80年代期間，黏蟲多次在全國范圍內(nèi)暴發(fā)成災(zāi)，造成嚴重的經(jīng)濟損失。90年代后，隨著全國小麥種植面積銳減，加之測報與防治技術(shù)的完善，黏蟲得到有效控制。近年來，受耕作制度和全球氣候變化等因素的影響，黏蟲在我國局部地區(qū)暴發(fā)，其暴發(fā)頻率、危害程度及危害面積為近20年之最，對我國的糧食安全生產(chǎn)已構(gòu)成嚴重威脅。黏蟲的暴發(fā)與其遷飛為害和暴食能力相關(guān)，其強大的生殖能力也是其暴發(fā)的重要原因。黏蟲無滯育特性，在適宜條件下1年可以繁殖數(shù)代，雌成蟲可多次交配，單雌產(chǎn)卵量達500～1 000粒。昆蟲的產(chǎn)卵主要受生殖相關(guān)基因的調(diào)控，因此開展黏蟲生殖相關(guān)基因的研究可望為該害蟲的防治提供新途徑。

卵黃發(fā)生是昆蟲生殖調(diào)控的關(guān)鍵，與昆蟲種群數(shù)量的消長密切相關(guān)。目前，關(guān)于黏蟲生殖的研究主要集中在卵黃原蛋白及其受體方面。例如，在黏蟲中已經(jīng)報道了2個卵黃原蛋白(vitellogenin，簡稱Vg)及其受體(vitellogenin receptor，簡稱VgR)基因，發(fā)現(xiàn)這2個基因主要在黏蟲雌成蟲脂肪體和卵巢高表達；進一步研究發(fā)現(xiàn)，沉默相關(guān)基因后黏蟲卵的形態(tài)畸形，產(chǎn)卵量明顯下降，從而驗證了這2個基因在黏蟲生殖中的功能。昆蟲的生殖是一個復(fù)雜的過程，受多個基因的調(diào)控。熱激蛋白(HSPs)作為一種分子伴侶在昆蟲抵御環(huán)境脅迫中發(fā)揮重要作用，然而近年來的研究發(fā)現(xiàn)HSPs參與多種昆蟲的生殖。以飛蝗為例，研究發(fā)現(xiàn)和在飛蝗的脂肪體中高表達；沉默這2個基因后導(dǎo)致飛蝗卵黃蛋白表達水平顯著降低，同時卵母細胞發(fā)育遲緩；敲除和后飛蝗Vg的合成和卵母細胞的成熟嚴重受阻。這些結(jié)果表明，HSPs通過調(diào)控昆蟲Vg的合成而控制昆蟲的生殖。然而，HSPs是否參與黏蟲的生殖還未見報道。

HSC70互作蛋白(HSC70 interacting protein，簡稱HIP)是一種高度保守的協(xié)同分子伴侶。該蛋白主要通過由34個氨基酸組成的保守結(jié)構(gòu)域TPR(tetratricopeptide repeats)與HSC70 C-端的EEVD結(jié)合，從而調(diào)控HSC70的功能。目前，HIP已在人類、擬南芥、果蠅、番茄等生物中被相繼報道，并已證實其在生物抵御各種生物脅迫中發(fā)揮重要作用。然而，HIP在參與動植物生殖的研究還未見報道。最近，筆者所在課題組在分析黏蟲4日齡雌蟲卵巢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)時發(fā)現(xiàn)，在卵巢中高表達，暗示其可能在黏蟲的生殖中具有重要作用。為此，本研究采用RT-PCR從黏蟲克隆了的基因，并采用實時熒光定量PCR分析了其在黏蟲不同發(fā)育時期，4日齡雌成蟲不同組織中的表達模式，以期為進一步研究在黏蟲生殖中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間

試驗于2021年1—3月在貴州省植物保護研究所完成。

1.2 供試蟲源及試劑

供試蟲源：本試驗所用黏蟲為長期飼養(yǎng)在貴州省植物保護研究所的室內(nèi)種群，至今飼養(yǎng)30代以上，期間未接觸任何殺蟲劑。飼養(yǎng)條件為光—暗周期 14 h—10 h、溫度為24～25 ℃、濕度為70%～80%，具體飼養(yǎng)過程參照李鴻波等的方法進行。

供試試劑：EastepR Super Total RNA isolation Kit購自Promega公司；cDNA第1鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo 公司；iScriptcDNA Synthesis Kit和SsoAdvancedUniversal SYBR Green Supermix購自Bio-RAD公司；LA酶、DL2000 marker等購自TaKaRa公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 總RNA提取，cDNA第1鏈合成和RT-PCR

按照Eastep? Super Total RNA isolation Kit提供的方法提取樣品總RNA，利用DNAaseI 去除基因組DNA，并采用oligo(dT)引物(Thermo Scientific，USA) 合成 cDNA第1鏈，存于-20 ℃下備用?；诠P者所在實驗室前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，鑒定得到1個長1 218 bp的基因序列，初步分析發(fā)現(xiàn)該基因具有完整的開放閱讀框。據(jù)此序列設(shè)計1對特異性引物，以4日齡雌成蟲卵巢反轉(zhuǎn)錄而來的cDNA為模板，采用RT-PCR進行擴增(表1)，擴增參數(shù)為：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性30 s，54 ℃ 退火 1 min，72延伸30 s，共30個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。 反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，將符合目標(biāo)條帶大小的PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測序。

表1 試驗中的引物信息

1.4 基因序列分析和進化樹構(gòu)建

采用ORF Finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)鑒定的開放閱讀框和氨基酸序列；采用Compute pI/Mw(https：//web.expasy.org/compute_pi/)鑒定分子量和等電點；利用NCBI CDD(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)鑒定HIP的保守結(jié)構(gòu)域；使用MEGA 5.1中的臨接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap取樣值設(shè)置為1 000次。

1.5 MsHIP的時空表達分析

1.5.1 樣品收集 收集黏蟲不同發(fā)育階段(包括卵、1～6齡幼蟲、蛹和4日齡雌成蟲)和4日齡雌成蟲不同組織(頭、胸部、觸角、翅、中腸、脂肪體和卵巢)樣品，立刻用液氮速凍，存于-80 ℃下，用于總RNA的提取。每個樣品重復(fù)4次。

1.5.2 Real-time PCR分析 基于基因序列設(shè)計特異性引物，以和為內(nèi)參基因，并以不同發(fā)育階段和不同組織樣品的cDNA為模板，在CFX-96 PCR儀(Bio-Rad，USA)進行qRT-PCR。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括SsoAdvancedUniversal SYBR Green Supermix(Bio-Rad) 10 μL，上下游引物各1 μL(表1)，模板cDNA 1 μL，ddHO 7 μL。qRT-PCR程序為95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，退火溫度下 30 s，共35個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后確認擴增曲線和熔解曲線。采用2-ΔΔ法計算黏蟲在不同發(fā)育階段和不同組織中的相對表達量。每個樣品含4個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)含3個技術(shù)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有表達量數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。采用DPS 17.0中的單因素方差分析法(One-Way ANOVA)分別分析不同發(fā)育時期和不同組織處理表達量間的差異顯著性(=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsHIP的序列特征分析

通過RT-PCR獲得的序列全長為1 215 bp，命名為，GenBank登錄號為OK474875。編碼405個氨基酸(aa)，預(yù)測的分子量為44.04 ku，等電點為4.93。采用NCBI中的保守結(jié)構(gòu)域搜索發(fā)現(xiàn)，中存在昆蟲HIP的3個保守結(jié)構(gòu)域，分別是1個位于N-端的二聚體結(jié)構(gòu)域(7～47 aa)，1個TPR結(jié)構(gòu)域(TPR1，123～156 aa，TPR2，157～190 aa，TPR3，191～224 aa)和1個位于C-端的U-box結(jié)構(gòu)域(圖1)。多序列比對分析發(fā)現(xiàn)，夜蛾科昆蟲的HIP結(jié)構(gòu)比較保守，均具有定義HIP蛋白的3個保守結(jié)構(gòu)域(圖1)。

2.2 鱗翅目昆蟲HIP系統(tǒng)發(fā)育分析

通過NCBI搜索比對，發(fā)現(xiàn)黏蟲的HIP氨基酸序列與棉鈴蟲()的 HIP 氨基酸序列相似度最高，為86.62%，其次為草地貪夜蛾()(86.54%)和斜紋夜蛾()(85.34%)，與粉紋夜蛾()的相似度為82.57%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，該系統(tǒng)樹被明顯分為2支，即鱗翅目和雙翅目。在鱗翅目夜蛾科中，黏蟲HIP與棉鈴蟲HIP的親緣關(guān)系最近，以較高的支持率(66.00%)聚在一起(圖2)。

2.3 MsHIP時空表達分析

在黏蟲各發(fā)育階段的表達差異顯著(=5260，=8，35，<0.001)。其中，以4日齡成蟲的表達量最高，是對照(卵)的45.28倍；其次為6齡幼蟲，表達量是對照的36.90倍；在其余發(fā)育階段的表達量較低，均與對照相比差異不顯著(圖3-A)。

在4日齡成蟲不同組織中表達差異顯著(=3052，=6，27，<0.001)。其中，在卵巢中的表達水平最高，是對照(頭)的18.55倍；其次為脂肪體，其表達水平是對照的13.58倍；在胸、觸角、翅和中腸中表達水平較低，與對照相比差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

HSPs作為分子伴侶在調(diào)控昆蟲生殖中的作用已得到證實。本研究基于前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，結(jié)合RT-PCR獲得的全長序列，是GenBank中登錄的第24個昆蟲的HIP序列。同已報道的HIP一樣，MsHIP含有3大保守結(jié)構(gòu)域，即二聚體結(jié)構(gòu)域、TPR結(jié)構(gòu)域和U-box結(jié)構(gòu)域。N-端的二聚體結(jié)構(gòu)域的主要功能是作為一種調(diào)控因子調(diào)控HSP70的功能；TPR是由34個氨基酸組成的多肽，其功能主要是直接與HSP/HSC70和HSP90 中ATPase 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，減緩ADP的釋放速度；U-box具有E3泛素化抑制劑連接酶和多聚泛素化鏈延伸活力，有助于加速依賴泛素化的分子伴侶基質(zhì)的降解?；邝[翅目昆蟲HIP的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，黏蟲主要與斜紋夜蛾、草地貪夜蛾、粉紋夜蛾和棉鈴蟲聚在一起，且與棉鈴蟲的親緣關(guān)系最近，支持率高達66.00%，同屬夜蛾科。這幾種昆蟲HIP的分子結(jié)構(gòu)、氨基酸相似度(82.57%～86.62%)及田間多食性特點都佐證了以上結(jié)論，表明他們可能來源于同一祖先，因自然選擇壓力而發(fā)生分化。

HSPs的表達具有發(fā)育階段和組織特性。本研究發(fā)現(xiàn)，在所有發(fā)育時期均表達，但其在不同時期的表達模式存在差異，這與已報道的其他昆蟲的HSPs的表達規(guī)律不一致。例如，赤擬谷盜在蛹早期和成蟲早期的表達量最高；褐飛虱、、、和在成蟲中的表達水平最高，則在5齡幼蟲中表達量最高，而和在所測試的發(fā)育階段表達量都很低；對三葉斑潛蠅()而言，在所有發(fā)育階段的表達十分恒定，在蛹和成蟲中高表達，而則只在雌成蟲中高表達。在黏蟲中，在2齡和6齡幼蟲中高表達，則在黏蟲1 齡幼蟲中高表達，而在6齡幼蟲和4日齡雌成蟲高表達。這些結(jié)果說明，不同的HSPs在不同物種的生長發(fā)育過程中發(fā)揮不同的作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)在4日齡雌成蟲中高表達的現(xiàn)象與黏蟲卵黃原蛋白受體基因()和脂蛋白受體基因()(另文發(fā)表)的表達規(guī)律基本一致，表明可能參與黏蟲的生殖。

為進一步明確該基因是否在黏蟲的生殖中發(fā)揮作用，進一步檢測了其在成蟲不同組織中的表達情況。結(jié)果顯示，在卵巢和脂肪體中高表達，這與棉鈴蟲、大螟和草地貪夜蛾在不同組織中的表達規(guī)律不一致，但與褐飛虱中、、、的表達規(guī)律類似。和在昆蟲的生殖中發(fā)揮重要作用，其中脂肪體是卵黃原蛋白合成的主要場所，而卵巢則是卵母細胞發(fā)育的主要場所。李杰研究發(fā)現(xiàn)，在黏蟲脂肪體和卵巢中高表達，采用RNAi沉默該基因后，其在脂肪體和卵巢中的表達水平顯著降低，同時卵的發(fā)育畸形，產(chǎn)卵量顯著減少，從而證明了在黏蟲的生殖中發(fā)揮重要作用。基于與在黏蟲雌蟲生殖器官中表達規(guī)律的一致性，因此推測在黏蟲的生殖中也發(fā)揮重要作用。

綜上，本研究首次從黏蟲中克隆了基因，發(fā)現(xiàn)具有昆蟲定義的3個保守結(jié)構(gòu)域，并且在黏蟲的雌成蟲及脂肪體和卵巢中高表達，表明其在黏蟲生殖中具有重要作用。