曾慶花，黃慧，楊娜，李智明，鄧?guó)Q

(廣西食品藥品檢驗(yàn)所，南寧 530021)

復(fù)方甘草口服溶液是由甘草流浸膏、復(fù)方樟腦酊、甘油、愈創(chuàng)甘油醚、濃氨溶液及水混合制成[1]，主要用于上呼吸道感染、支氣管炎和感冒引起的咳嗽以及咳痰不爽，是臨床上常用的祛痰鎮(zhèn)咳藥[2]。復(fù)方甘草口服溶液中的復(fù)方樟腦酊含有防腐劑苯甲酸。防腐劑作為藥物制劑中重要組成部分，在防止藥品被微生物污染、確保藥品質(zhì)量方面起著重要作用。由于防腐劑具有一定的毒性，因此《中國(guó)藥典》(2020 版)通則對(duì)防腐劑的品種與用量作了具體規(guī)定，如山梨酸和苯甲酸的用量不得超過(guò)0.3%(其鉀鹽、鈉鹽的用量分別按酸計(jì))，羥苯酯類(lèi)的用量不得超過(guò)0.05%[3-5]。

測(cè)定復(fù)方甘草口服溶液中苯甲酸含量的方法已有文獻(xiàn)[6]報(bào)道，但因國(guó)內(nèi)復(fù)方甘草口服溶液生產(chǎn)企業(yè)所加防腐劑的種類(lèi)與用量不同，為有效篩查復(fù)方甘草口服溶液中防腐劑是否符合《中國(guó)藥典》限量要求，筆者參考文獻(xiàn)[7-16]，對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方甘草口服溶液中苯甲醇、苯酚、苯甲酸、山梨酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯8 種常見(jiàn)防腐劑。該方法具有樣品處理簡(jiǎn)單，分離效果好等特點(diǎn)，可用于復(fù)方甘草口服溶液中多種防腐劑的篩查和同時(shí)測(cè)定，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters e2695 型，配有Empower 2工作站，美國(guó)Waters 公司。

電子天平：XS205DU 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

乙腈：色譜純，德國(guó)默克股份有限公司。

苯甲醇、苯酚、苯甲酸、山梨酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸丁酯8 種防腐劑對(duì)照品：具體信息見(jiàn)表1，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

表1 8 種防腐劑含量和批號(hào)

乙酸銨、冰乙酸：均為分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

復(fù)方甘草口服溶液：市售。

實(shí)驗(yàn)用水為去離子水，由密理博純水儀制得。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：SHISEIDO CAPCELL MG ⅡC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本資生堂公司)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：苯甲醇、苯酚為211 nm，苯甲酸為225 nm，山梨酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸丁酯為256 nm；流動(dòng)相：A 為乙腈，B 為20 mmol/L 乙酸銨溶液(用冰乙酸調(diào)節(jié)溶液pH 5.0)，流量為1.0 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫程序1）

1.3 溶液配制

1.3.1 8 種防腐劑混合對(duì)照品儲(chǔ)備液

分別稱(chēng)取苯甲醇、苯酚、苯甲酸、山梨酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋成8 種防腐劑質(zhì)量濃度分別為8.0、3.0、3.0、3.0、0.5、0.5、0.5、0.5 mg/mL 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.3.2 8 種防腐劑系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

精密移取8 種防腐劑混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，分別置于7 只100 mL容量瓶中，用50%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇溶液稀釋至標(biāo)線(xiàn)，配制成苯甲醇質(zhì)量濃度分別為8.0、16.0、40.0、80.0、160.0、400.0、800.0 μg/mL，苯酚、苯甲酸和山梨酸的質(zhì)量濃度均分別為3.0、6.0、15.0、30.0、60.0、150.0、300.0 μg/mL，對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯的質(zhì)量濃度均分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 樣品溶液

精密移取復(fù)方甘草口服溶液1 mL，置于100 mL 容量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋至標(biāo)線(xiàn)，搖勻，經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

取8 種防腐劑系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及樣品溶液，按1.2 儀器工作條件進(jìn)樣分析，建立8 種防腐劑的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，計(jì)算線(xiàn)性方程，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算樣品中防腐劑的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器工作條件選擇

2.1.1 流動(dòng)相

參考文獻(xiàn)[7-16]，分別對(duì)甲醇-水、甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨溶液(用冰乙酸調(diào)節(jié)至pH 5.0)、乙腈-水、乙腈-0.02 mol/L 乙酸銨溶液(用冰乙酸調(diào)節(jié)至pH 5.0) 4 種流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果表明，采用甲醇-水、乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，苯甲醇、苯甲酸、山梨酸不能有效分離；采用甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨溶液為流動(dòng)相時(shí)，樣品溶液中其它成分對(duì)山梨酸和對(duì)羥基苯甲酸甲酯的測(cè)定有干擾；而采用乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相時(shí)，通過(guò)優(yōu)化梯度洗脫程序，可使各成分實(shí)現(xiàn)良好的分離，色譜峰形良好，且樣品溶液中其它成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，故選擇乙腈-0.02 mol/L 乙酸銨溶液(用冰乙酸調(diào)節(jié)至pH 5.0)為流動(dòng)相。以乙腈-0.02 mol/L 乙酸銨溶液(用冰乙酸調(diào)節(jié)至pH 5.0)為流動(dòng)相，在不同分析波長(zhǎng)下，8 種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品溶液的色譜圖分別如圖1、圖2 所示。

圖1 不同分析波長(zhǎng)下8 種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 不同分析波長(zhǎng)下加標(biāo)樣品溶液色譜圖

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)

采用二極管陣列檢測(cè)器在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)分別對(duì)8 種防腐劑進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苯酚分別在211、270 nm 處有最大吸收，苯甲醇分別在213、257 nm 處有最大吸收，苯甲酸分別在225、269 nm 處有最大吸收，山梨酸與對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)的最大吸收波長(zhǎng)均為256 nm。考慮苯甲醇、苯酚、苯甲酸分別在257、270、269 nm 波長(zhǎng)處響應(yīng)值較小，故選擇211 nm 作為苯甲醇、苯酚的測(cè)定波長(zhǎng)，225 nm 作為苯甲酸的測(cè)定波長(zhǎng)，256 nm 作為山梨酸和對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 線(xiàn)性方程與檢出限

按1.2 儀器工作條件分別測(cè)定1.3 中的8 種防腐劑系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以待測(cè)防腐劑質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，μg/mL)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，計(jì)算線(xiàn)性方程和相關(guān)系數(shù)。取系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中質(zhì)量濃度最小的溶液，用50%甲醇溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)?.2 儀器工作條件測(cè)定，并記錄色譜峰面積，分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為各種防腐劑的檢出限和定量限。8 種防腐劑質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見(jiàn)表3。

表3 質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.3 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

采用向樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。精密吸取同一批復(fù)方甘草口服溶液樣品0.4、0.5、0.6 mL 各3 份，分別置于100 mL 容量瓶中，分別對(duì)應(yīng)加入8 種防腐劑混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.4、0.5、0.6 mL，用50%甲醇溶液稀釋至標(biāo)線(xiàn)，搖勻，作為低、中、高3 種質(zhì)量濃度水平的加標(biāo)樣品溶液，在1.2 儀器工作條件分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率和測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4 可知，8 種防腐劑加標(biāo)回收率為98.3%～105.1%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～6.5%。表明該方法測(cè)量準(zhǔn)確度和精密度良好，可用于復(fù)方甘草口服溶液中防腐劑的檢測(cè)。

表4 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對(duì)羥基苯甲酸甲酯質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL的8 種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別于配制完成后第0、4、8、12、24、48 h 測(cè)定，記錄各防腐劑的色譜峰面積，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表5 可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～1.5%，表明8 種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性均良好。

3 結(jié)語(yǔ)

建立了檢測(cè)復(fù)方甘草口服溶液中苯甲醇、苯酚、苯甲酸、山梨酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯8種防腐劑的高效液相色譜方法。該方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度良好，可快速篩查復(fù)方甘草口服溶液中防腐劑的含量，為評(píng)價(jià)其安全性提供依據(jù)。