曾慶花,黃慧,楊娜,李智明,鄧鳴
(廣西食品藥品檢驗(yàn)所,南寧 530021)
復(fù)方甘草口服溶液是由甘草流浸膏、復(fù)方樟腦酊、甘油、愈創(chuàng)甘油醚、濃氨溶液及水混合制成[1],主要用于上呼吸道感染、支氣管炎和感冒引起的咳嗽以及咳痰不爽,是臨床上常用的祛痰鎮(zhèn)咳藥[2]。復(fù)方甘草口服溶液中的復(fù)方樟腦酊含有防腐劑苯甲酸。防腐劑作為藥物制劑中重要組成部分,在防止藥品被微生物污染、確保藥品質(zhì)量方面起著重要作用。由于防腐劑具有一定的毒性,因此《中國藥典》(2020 版)通則對防腐劑的品種與用量作了具體規(guī)定,如山梨酸和苯甲酸的用量不得超過0.3%(其鉀鹽、鈉鹽的用量分別按酸計(jì)),羥苯酯類的用量不得超過0.05%[3-5]。
測定復(fù)方甘草口服溶液中苯甲酸含量的方法已有文獻(xiàn)[6]報(bào)道,但因國內(nèi)復(fù)方甘草口服溶液生產(chǎn)企業(yè)所加防腐劑的種類與用量不同,為有效篩查復(fù)方甘草口服溶液中防腐劑是否符合《中國藥典》限量要求,筆者參考文獻(xiàn)[7-16],對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了高效液相色譜法同時(shí)測定復(fù)方甘草口服溶液中苯甲醇、苯酚、苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯8 種常見防腐劑。該方法具有樣品處理簡單,分離效果好等特點(diǎn),可用于復(fù)方甘草口服溶液中多種防腐劑的篩查和同時(shí)測定,為其質(zhì)量評價(jià)提供參考。
高效液相色譜儀:Waters e2695 型,配有Empower 2工作站,美國Waters 公司。
電子天平:XS205DU 型,感量為0.1 mg,瑞士梅特勒-托利多公司。
乙腈:色譜純,德國默克股份有限公司。
苯甲醇、苯酚、苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯8 種防腐劑對照品:具體信息見表1,中國食品藥品檢定研究院。
表1 8 種防腐劑含量和批號
乙酸銨、冰乙酸:均為分析純,中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。
復(fù)方甘草口服溶液:市售。
實(shí)驗(yàn)用水為去離子水,由密理博純水儀制得。
色譜柱:SHISEIDO CAPCELL MG ⅡC18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,日本資生堂公司);柱溫:30 ℃;進(jìn)樣體積:10 μL;檢測波長:苯甲醇、苯酚為211 nm,苯甲酸為225 nm,山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯為256 nm;流動(dòng)相:A 為乙腈,B 為20 mmol/L 乙酸銨溶液(用冰乙酸調(diào)節(jié)溶液pH 5.0),流量為1.0 mL/min;洗脫方式:梯度洗脫,洗脫程序見表2。
表2 梯度洗脫程序1)
1.3.1 8 種防腐劑混合對照品儲(chǔ)備液
分別稱取苯甲醇、苯酚、苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯對照品適量,用甲醇溶解并稀釋成8 種防腐劑質(zhì)量濃度分別為8.0、3.0、3.0、3.0、0.5、0.5、0.5、0.5 mg/mL 的混合對照品儲(chǔ)備液。
1.3.2 8 種防腐劑系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液
精密移取8 種防腐劑混合對照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL,分別置于7 只100 mL容量瓶中,用50%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液稀釋至標(biāo)線,配制成苯甲醇質(zhì)量濃度分別為8.0、16.0、40.0、80.0、160.0、400.0、800.0 μg/mL,苯酚、苯甲酸和山梨酸的質(zhì)量濃度均分別為3.0、6.0、15.0、30.0、60.0、150.0、300.0 μg/mL,對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯的質(zhì)量濃度均分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
1.3.3 樣品溶液
精密移取復(fù)方甘草口服溶液1 mL,置于100 mL 容量瓶中,用50%甲醇溶液稀釋至標(biāo)線,搖勻,經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。
取8 種防腐劑系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及樣品溶液,按1.2 儀器工作條件進(jìn)樣分析,建立8 種防腐劑的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,計(jì)算線性方程,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中防腐劑的含量。
2.1.1 流動(dòng)相
參考文獻(xiàn)[7-16],分別對甲醇-水、甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨溶液(用冰乙酸調(diào)節(jié)至pH 5.0)、乙腈-水、乙腈-0.02 mol/L 乙酸銨溶液(用冰乙酸調(diào)節(jié)至pH 5.0) 4 種流動(dòng)相進(jìn)行考察,結(jié)果表明,采用甲醇-水、乙腈-水為流動(dòng)相時(shí),苯甲醇、苯甲酸、山梨酸不能有效分離;采用甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨溶液為流動(dòng)相時(shí),樣品溶液中其它成分對山梨酸和對羥基苯甲酸甲酯的測定有干擾;而采用乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相時(shí),通過優(yōu)化梯度洗脫程序,可使各成分實(shí)現(xiàn)良好的分離,色譜峰形良好,且樣品溶液中其它成分對測定無干擾,故選擇乙腈-0.02 mol/L 乙酸銨溶液(用冰乙酸調(diào)節(jié)至pH 5.0)為流動(dòng)相。以乙腈-0.02 mol/L 乙酸銨溶液(用冰乙酸調(diào)節(jié)至pH 5.0)為流動(dòng)相,在不同分析波長下,8 種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品溶液的色譜圖分別如圖1、圖2 所示。
圖1 不同分析波長下8 種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖
圖2 不同分析波長下加標(biāo)樣品溶液色譜圖
2.1.2 檢測波長
采用二極管陣列檢測器在200~400 nm 波長范圍內(nèi)分別對8 種防腐劑進(jìn)行掃描,結(jié)果發(fā)現(xiàn),苯酚分別在211、270 nm 處有最大吸收,苯甲醇分別在213、257 nm 處有最大吸收,苯甲酸分別在225、269 nm 處有最大吸收,山梨酸與對羥基苯甲酸酯類的最大吸收波長均為256 nm??紤]苯甲醇、苯酚、苯甲酸分別在257、270、269 nm 波長處響應(yīng)值較小,故選擇211 nm 作為苯甲醇、苯酚的測定波長,225 nm 作為苯甲酸的測定波長,256 nm 作為山梨酸和對羥基苯甲酸酯類的測定波長。
按1.2 儀器工作條件分別測定1.3 中的8 種防腐劑系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,以待測防腐劑質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x,μg/mL)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y),分別繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。取系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中質(zhì)量濃度最小的溶液,用50%甲醇溶液逐級稀釋,按1.2 儀器工作條件測定,并記錄色譜峰面積,分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為各種防腐劑的檢出限和定量限。8 種防腐劑質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表3。
表3 質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限
采用向樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。精密吸取同一批復(fù)方甘草口服溶液樣品0.4、0.5、0.6 mL 各3 份,分別置于100 mL 容量瓶中,分別對應(yīng)加入8 種防腐劑混合對照品儲(chǔ)備液0.4、0.5、0.6 mL,用50%甲醇溶液稀釋至標(biāo)線,搖勻,作為低、中、高3 種質(zhì)量濃度水平的加標(biāo)樣品溶液,在1.2 儀器工作條件分別進(jìn)行測定,計(jì)算回收率和測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表4。由表4 可知,8 種防腐劑加標(biāo)回收率為98.3%~105.1%,測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%~6.5%。表明該方法測量準(zhǔn)確度和精密度良好,可用于復(fù)方甘草口服溶液中防腐劑的檢測。
表4 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果
取對羥基苯甲酸甲酯質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL的8 種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別于配制完成后第0、4、8、12、24、48 h 測定,記錄各防腐劑的色譜峰面積,結(jié)果見表5。
表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
由表5 可知,測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%~1.5%,表明8 種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性均良好。
建立了檢測復(fù)方甘草口服溶液中苯甲醇、苯酚、苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯8種防腐劑的高效液相色譜方法。該方法操作簡單,準(zhǔn)確度良好,可快速篩查復(fù)方甘草口服溶液中防腐劑的含量,為評價(jià)其安全性提供依據(jù)。