苗會娟，胡衛(wèi)國，徐艷梅，郝麗娟，高燕霞

(1.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，石家莊 050011； 2.華北制藥股份有限公司，石家莊 050200； 3.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300350)

蜂毒是意大利蜂用電刺激方法采集的毒腺分泌物，經(jīng)過醇沉、萃取等工藝，提取而制得的凍干粉末，是一種成分復(fù)雜的混合物，主要包括肽類、酶類、生物胺、有機(jī)酸、礦物質(zhì)等[1-4]，其中蜂毒肽約占蜂毒干重的50%，是其最主要的成分[5]。蜂毒具有祛風(fēng)除濕的功效，可用于治療關(guān)節(jié)疼痛、肢體沉重，急性風(fēng)濕病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥候[6-8]，同時(shí)還可以增強(qiáng)人體免疫力，是一種潛在的新冠肺炎治療藥物。

由于蜂毒結(jié)構(gòu)復(fù)雜，影響藥物穩(wěn)定性的成分較多[9]，而總蛋白質(zhì)量的變化在一定程度上可以反映藥物的穩(wěn)定性。準(zhǔn)確測定蜂毒中總蛋白質(zhì)含量一方面可以作為質(zhì)量控制的目標(biāo)和手段，另一方面可以提高用藥的科學(xué)性和精準(zhǔn)性，因此建立規(guī)范科學(xué)的方法測定蜂毒中總蛋白質(zhì)含量具有重要意義?，F(xiàn)行蜂毒標(biāo)準(zhǔn)收載于國家藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品地標(biāo)升國標(biāo)第十六冊，標(biāo)準(zhǔn)號為WS1-XG-016—2001。該標(biāo)準(zhǔn)中總蛋白含量采用雙縮脲法測定，但該方法在配制對照品溶液和樣品溶液時(shí)所用的溶劑不同，前者采用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液，后者則采用純水配制，測定波長設(shè)定為660 nm，而不是蛋白質(zhì)-鉬-鎢復(fù)合物的最大吸收波長750 nm 或者650 nm[10]，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性?，F(xiàn)有文獻(xiàn)多對蜂毒中某一種或者某一類特定組分，如蜂毒肽[5]、蜂毒明肽[11]、磷脂酶A2[12]含量等進(jìn)行測定。例如采用高效液相色譜法結(jié)合熒光檢測器對蜂毒中蜂毒肽類的含量進(jìn)行測定[13]，但該方法存在定量限較高、準(zhǔn)確度和精密度較差，且抗干擾能力差等缺點(diǎn)。隨著液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)技術(shù)的發(fā)展與普及，LC-MS 法在各種基質(zhì)中蜂毒肽的定量中均有應(yīng)用[14-16]。然而LC-MS 法離子化效率不高，導(dǎo)致靈敏度較低[13-14]。

《中國藥典》2020 年版[17]通則0731 中共收錄了紫外-可見分光光度法、凱氏定氮法、雙縮脲法、福林酚法、考馬斯亮藍(lán)染色法及2，2′-聯(lián)喹啉-4，4′-二羧酸法(BCA 法) 6 種測定蛋白質(zhì)含量的方法。其中紫外-可見分光光度法只適用于蛋白質(zhì)的初步篩查；凱氏定氮法和雙縮脲法靈敏度低，且無機(jī)含氮化合物干擾測定結(jié)果。因?yàn)榉涠韭云珘A性，考馬斯亮藍(lán)法和BCA 法不適用于測定蜂毒中蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)中含有酚基的氨基酸殘基(如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)，在堿性條件下能夠?qū)⒏Ａ衷囈褐械牧鶅r(jià)鎢還原成五價(jià)鎢，而使溶液顯藍(lán)色，并且溶液顏色的深淺與溶液濃度成正比，因此福林酚法廣泛應(yīng)用于酚類及蛋白質(zhì)含量的測定[18-20]。但通則中的堿性銅溶液未加入二硫蘇糖醇，測定波長未選用反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長，同樣影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。筆者在此基礎(chǔ)上對測定波長和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，建立了福林酚法測定蜂毒中總蛋白質(zhì)含量的方法。該方法操作簡單，準(zhǔn)確度及精密度良好，可為蜂毒的生產(chǎn)、質(zhì)量控制和臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為蜂毒標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

紫外-可見分光光度儀：UV2600 型，日本島津公司。

移液槍：1 mL、5 mL，A 級，美國Eppendorf 公司。

電子天平：XS105 型，感應(yīng)量為0.01 mg，美國梅特勒-托利多公司。

蜂毒樣品：批號分別為FD20211101、FD20211102、FD20211103，華北制藥華坤河北生物技術(shù)有限公司。

血清白蛋白(牛)對照品：22.2 mg/支，批號為140619-202125，中國食品藥品檢定研究院。

福林酚貯備液：酸濃度為1 mol/L，批號為210807，北京索萊寶科技有限公司。

碳酸鈉、酒石酸、硫酸銅、氫氧化鈉：均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為純化水。

1.2 溶液配制

堿性銅溶液：稱取氫氧化鈉10 g、碳酸鈉50 g，加入400 mL水溶解，作為甲溶液；稱取酒石酸0.5 g，加入50 mL 水溶解，另稱取硫酸銅0.25 g，加入30 mL 水溶解，將兩溶液混合作為乙溶液。臨用前，合并甲、乙溶液，并加水定容至500 mL。

福林酚溶液：酸濃度為0.125 mol/L，移取福林酚貯備液12.5 mL，加水稀釋至100 mL，混勻。

血清白蛋白(牛)對照品溶液：222 μg/mL，取血清白蛋白(牛)對照品1 支，加水約1 mL 溶解，將溶液轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，用水多次洗滌西林瓶，洗液并入同一容量瓶中，加水稀釋至標(biāo)線，混勻。

血清白蛋白(牛)系列對照品溶液：用水將血清白蛋白(牛)對照品溶液逐級稀釋成蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度分別為44、88、132、176、220 μg/mL 的系列對照品溶液。

蜂毒樣品溶液：200 μg/mL，精密稱取蜂毒樣品約0.1 g，置于100 mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置于25 mL 容量瓶中，加水稀釋至標(biāo)線，搖勻。

1.3 測定方法

精密量取血清白蛋白(牛)系列對照品溶液各1 mL，分別置于具塞試管中，分別精密加入堿性銅溶液1 mL，搖勻，于室溫下放置10 min，然后分別精密加入福林酚溶液4 mL，立即混勻，于25 ℃下反應(yīng)40 min，在750 nm 波長處測定溶液的吸光度。以蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度為自變量、以相應(yīng)的吸光度為因變量進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。另精密量取0.5 mL 蜂毒樣品溶液和0.5 mL 水，置于具塞試管中，同法測定。利用線性方程計(jì)算蜂毒樣品溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，根據(jù)稱樣量、定容體積和稀釋倍數(shù)換算成樣品中的含量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。以水代替對照品溶液作為空白，同法測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑選擇

蜂毒樣品和血清白蛋白(牛)對照品均易溶于水，故選擇純水作為溶劑。

2.2 檢測波長選擇

分別取血清白蛋白(牛)對照品溶液和蜂毒樣品溶液，按照1.3 方法進(jìn)行反應(yīng)，于490～900 nm 可見光波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，吸收光譜如圖1 所示。由圖1 可以看出，血清白蛋白(牛)對照品溶液和蜂毒樣品溶液均在750 nm 處有最大吸收，因此選擇檢測波長為750 nm。

圖1 血清白蛋白(牛)對照品溶液和蜂毒樣品溶液吸收光譜圖

2.3 樣品溶液質(zhì)量濃度選擇

取蜂毒樣品(批號為FD20211101)，按照1.2 方法配制5 種質(zhì)量濃度的樣品溶液，按照1.3 方法分別進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。由表1 可知，隨著樣品溶液質(zhì)量濃度的增加，總蛋白質(zhì)含量測定值基本不變，表明樣品的質(zhì)量濃度在線性范圍內(nèi)時(shí)，測量結(jié)果具有良好的重復(fù)性。但測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差隨著溶液質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先降低后基本穩(wěn)定的趨勢。當(dāng)樣品溶液質(zhì)量濃度為200 μg/mL，即參加反應(yīng)的樣品溶液質(zhì)量濃度為100 μg/mL 時(shí)，RSD 趨于穩(wěn)定，因此選擇樣品溶液質(zhì)量濃度為200 μg/mL。

表1 樣品溶液不同質(zhì)量濃度時(shí)的測定結(jié)果

2.4 福林酚溶液用量選擇

取蜂毒樣品溶液5 份，各加入堿性銅溶液1 mL，然后分別加入福林酚溶液1.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，按照1.3 方法測定溶液的吸光度，結(jié)果如圖2所示。由圖2 可以看出，當(dāng)福林酚溶液加入量為4.0～6.0 mL 時(shí)，吸光度趨于平穩(wěn)，故選擇福林酚溶液用量為4.0 mL。

圖2 不同福林酚溶液用量的吸光度

2.5 堿性銅溶液用量選擇

取蜂毒樣品溶液5 份，分別加入堿性銅溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，然后各加入福林酚溶液4.0 mL，按照1.3 方法測定溶液的吸光度，結(jié)果如圖3所示。由圖3 可以看出，當(dāng)堿性銅溶液加入量為1.0 mL 時(shí)，吸光度最大。較大的吸光度數(shù)值有利于提高測定結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確性，因此選擇堿性銅溶液用量為1.0 mL。

圖3 不同堿性銅溶液用量的吸光度

2.6 反應(yīng)溫度選擇

取蜂毒樣品溶液，按照1.3 方法，設(shè)定反應(yīng)時(shí)間為40 min，分別考察反應(yīng)溫度為25、40、55 ℃時(shí)的測定結(jié)果，結(jié)果表明，3 種反應(yīng)溫度條件下總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定值分別為94.5%、94.2%和94.6%，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差別。相比之下25 ℃時(shí)操作更加簡單、便捷，故選擇反應(yīng)溫度為25 ℃。

2.7 反應(yīng)時(shí)間選擇

取蜂毒樣品溶液，按照1.3 方法，設(shè)定反應(yīng)溫度為25 ℃，分別考察反應(yīng)時(shí)間為20、30、40、50、60 min時(shí)的測定結(jié)果，不同反應(yīng)時(shí)間時(shí)的吸光度如圖4 所示。由圖4 可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，吸光度逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到40 min 時(shí)，吸光度達(dá)到最大值并趨于穩(wěn)定，因此選擇反應(yīng)時(shí)間為40 min。

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間的吸光度

2.8 線性方程與定量限

取血清白蛋白(牛)系列對照品溶液，按照1.3方法分別進(jìn)行測定，以蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度為自變量(x)、以相應(yīng)的吸光度為因變量(y)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得線性方程為y=3.078 8x+0.025 7，相關(guān)系數(shù)為0.999 0，質(zhì)量濃度線性范圍為44.4～222.0 μg/mL。

按照1.3 方法，對空白溶液連續(xù)測定11 次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差和線性方程的斜率[21]，計(jì)算方法定量限為4.6 μg/mL。

2.9 精密度試驗(yàn)

稱取蜂毒樣品(批號為FD20211103) 0.107 5、0.111 0、0.114 2、0.113 6、0.107 2、0.113 3 g，分別置于100 mL 容量瓶中，按1.2 方法配制樣品溶液，按照1.3 方法分別進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。由表2 可知，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%，表明該方法具有良好的精密度，滿足測定要求。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.10 加標(biāo)回收試驗(yàn)

平行移取3 份蜂毒樣品溶液，各0.25 mL，分別精密加入血清白蛋白(牛)對照品溶液0.15、0.25、0.35 mL，按1.3 方法每份樣品測定3 次，結(jié)果見表3。由表3 可知，低、中和高3 種加標(biāo)水平的回收率分別為104.53%、100.46%和96.56%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語

建立了福林酚分光光度法測定蜂毒中總蛋白質(zhì)的方法，并考察了該法的精密度、準(zhǔn)確度、回收率和定量限。結(jié)果表明，各技術(shù)參數(shù)均滿足檢測要求，建立的方法科學(xué)可行，可為蜂毒的質(zhì)量控制提供技術(shù)依據(jù)。