張園園，朱瑤迪,2，李苗云*，趙莉君，劉世杰，趙改名，馬陽陽，王心怡

（1.河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，河南鄭州 450000）

（2.河南恒都食品有限公司博士后工作站，河南駐馬店 463700）

隨著我國經(jīng)濟進入新常態(tài)，消費者越來越注重生活質量的提高，熟肉制品因具有營養(yǎng)、美味、即食等優(yōu)點，深受人民喜愛。目前市場上的熟肉制品主要包括醬鹵肉制品、發(fā)酵肉制品、腌臘肉制品、熏燒烤制品、香腸制品、油炸制品及其他熟肉制品[1-2]。不同風味醬料品類的出現(xiàn)使人們對調味醬的消費需求在不斷提升，市場需求不斷擴大，我國調味醬產(chǎn)業(yè)發(fā)展呈現(xiàn)逐年增長趨勢[3-4]。熟肉制品和調味醬中富含豐富的脂肪和蛋白質，具有較高的水分活度，在制作和加工過程中一旦受到污染很容易造成微生物的大量繁殖，導致食品腐敗變質，甚至引發(fā)食源性疾病[5]。在高溫高濕季節(jié)，熟肉制品及醬料制品極易在貯藏、運輸和銷售過程中發(fā)生脹袋現(xiàn)象，造成大量的食物浪費和經(jīng)濟損失，是眾多食品企業(yè)面臨的主要問題之一[6]。

國內外有較多關于食品中脹袋微生物分離鑒定的報道，如楊穎等[7]從脹袋脆梅中分離出朗比克假絲酵母和藤黃微球菌；李靖等[8]研究發(fā)現(xiàn)引起紅油豆瓣醬脹罐的微生物是地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌；Silva 等[9]從脹袋的巴西真空包裝牛肉片中分離出嗜冷梭狀芽孢桿菌；高鵬等[10]從脹袋的真空包裝肘花中分離出地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和寡養(yǎng)單胞菌。但是有關引起紅燒肉和醬料包脹袋的污染微生物報道較少，對于不同脹袋污染微生物應進行不同的針對性分離、鑒定和分析。

本研究從企業(yè)高投訴率產(chǎn)品中選擇脹袋紅燒肉、脹袋番茄醬和脹袋牛排醬為研究對象，對其進行微生物多樣性分離培養(yǎng)，并通過形態(tài)學和分子生物學（16S rDNA）方法進行種屬鑒定，確定導致紅燒肉、番茄醬和牛排醬脹袋變質的關鍵微生物，并通過產(chǎn)氣驗證實驗通過確定導致產(chǎn)品脹袋的微生物。通過探究引起這些產(chǎn)品脹袋的原因，針對性地制定質量控制措施，減少食品中危險因素的污染，保障肉制品與醬料制品的安全性，從而減少企業(yè)損失，保障消費者的健康，為食品安全發(fā)展奠定一定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

脹袋紅燒肉，脹袋牛排醬，脹袋番茄醬，均為肉品企業(yè)提供脹袋樣品。

1.2 主要儀器與設備

德國IKA VORTEX GENIU 旋渦混勻儀，北京佳源興業(yè)科技有限公司；AL104 電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Nikon ECLIPSE 80i科研級顯微鏡，日本尼康公司；Electrotek AW200SG厭氧工作站，陜西鵬展科技有限公司；SHP-80 生化培養(yǎng)箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；日本HIRAYAMA-HVE50 高壓滅菌器，華粵行儀器有限公司；Biometra TGradient 梯度PCR 儀，濟南鑫貝西生物技術有限公司；德國Biometra DYY-12 電泳儀，北京市六一儀器廠；NAI-JZQ 滅菌型拍打式均質器，上海那艾實驗儀器有限公司。

1.3 主要試劑

營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基、強化梭菌瓊脂（RCM）培養(yǎng)基、乳酸細菌瓊脂（MRS）培養(yǎng)基、酵母膏胨葡萄糖瓊脂（YPD）培養(yǎng)基、胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂（TSC）培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒，均購于青島高科園海博生物技術有限公司；大腸桿菌測試片，購于長沙三行生物科技有限公司；PCR 檢測試劑盒、離心柱型細菌DNA 提取試劑盒，購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 多種培養(yǎng)基分離微生物

分別從不同脹袋食品中中稱取25 g 樣品，加到裝有225 mL 0.85%無菌生理鹽水中，使用均質器拍打混勻。使用0.85%無菌生理鹽水進行10 倍梯度稀釋。使用稀釋涂布平板法，取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋液各0.2 mL，分別涂布于NA、RCM、MRS、YPD 和TSC 平板上，大腸桿菌檢測選擇在大腸桿菌快檢試紙片上進行，進行厭氧和好氧培養(yǎng)并計數(shù)。觀察、記錄優(yōu)勢微生物的菌落特征，挑取優(yōu)勢單菌落分離純化3 次，最后接種到菌株磁珠保存管中，放于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 微生物鏡檢

使用革蘭氏染色法對分離純化后的菌株進行微生物鏡檢，并判別微生物是革蘭氏陽性還是陰性菌。通過觀察分離到的微生物在平板上的菌落形態(tài)與在顯微鏡下觀察到的個體形態(tài)，參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]對其進行初步判定。

1.4.3 微生物種屬鑒定

采用離心柱型細菌基因組DNA 序列提取試劑盒提取得到超純的基因組DNA[12-13]，用于PCR 后進行凝膠電泳成像，DNA 樣品由北京六合華大基因科技有限公司完成測序，進行菌株種屬鑒定。菌株PCR 擴增所用反應體系如表1 所示，反應程序如圖1 所示。

表1 PCR 擴增反應體系Table 1 PCR amplification reaction system

1.4.4 產(chǎn)氣微生物的驗證

配置NB 和YPD 液體培養(yǎng)基，分裝于試管中，放入杜氏管，115 ℃滅菌20 min 備用。將各培養(yǎng)基上挑選出來的典型菌株純化2～3 次，用無菌生理鹽水將其制備成菌懸液，無菌條件下用移液槍吸取一定量的菌懸液加入到滅過菌的產(chǎn)氣驗證試管中，每種3 個平行，37 ℃培養(yǎng)并連續(xù)觀察7 d，若管內產(chǎn)生氣泡則為產(chǎn)氣微生物。同時，用接入脹袋樣品懸濁液的和接入無菌生理鹽水的試管作為對照實驗，以確保實驗準確性。

2 結果與分析

2.1 分離菌株菌落及菌體形態(tài)觀察

通過對脹袋紅燒肉、牛排醬和番茄醬中的微生物進行分離、純化，三種脹袋產(chǎn)品在MRS、TSC 培養(yǎng)基和大腸桿菌檢測試紙片上均未檢出微生物，在NA、YPD和RCM 培養(yǎng)基均有菌檢出。根據(jù)各培養(yǎng)基上微生物的菌落形態(tài)進行分類，共得到9 種不同形態(tài)的優(yōu)勢菌，分別編號1～9，并進行形態(tài)觀察和革蘭氏染色鏡檢，菌落特征[14]和鏡檢結果如下表2 和圖2 所示。其中，菌株1號和5 號菌為革蘭氏陽性球菌，2、3、6、7 和9 號菌為革蘭氏陽性桿菌，4 號菌和8 號菌為革蘭氏陰性桿菌。

表2 9 種微生物的菌落形態(tài)Table 2 Colony morphology of nine gas producing microorganisms

2.2 細菌16S rDNA 基因序列同源性比對分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

1～9 號菌株的16S rDNA 擴增電泳結果如圖3 所示，序列基因序列全場約1500 bp。將測序得到的序列用BLAST軟件上傳至在NCBI-GenBank進行同源性檢索分析，并通過比對結果構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖4、表3 所示。分析可知，1 號菌株與多株枝狀葡萄球菌（Staphylococcus edaphicus）的同源性達99%以上，故鑒定 1 號菌為枝狀葡萄球菌（Staphylococcus edaphicus）。同理，2 號菌株為魏斯氏菌（Weissella cibaria），3 號菌株為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），4 號菌株為巴氏檸檬酸桿菌（Citrobacter braakii），5 號菌株為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），6 號菌株為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus strain），7號菌株為太平洋芽孢桿菌（Bacillus pacificus），8 號菌株為弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii），9號菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

表3 1～9 號菌16S rDNA 的BLAST 結果Table 3 BLAST results of 16S rDNA of No.1～9 strain

2.3 產(chǎn)氣驗證實驗結果

通過微生物產(chǎn)氣驗證實驗，確定了9 株菌株中導致紅燒肉和醬料包脹袋的產(chǎn)氣微生物，結果如表4 所示。經(jīng)產(chǎn)氣驗證試驗可確定3 號貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）、4 號巴氏檸檬酸桿菌（Citrobacter braakii）、6 號蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、7 號太平洋芽孢桿菌（Bacillus pacificus）和8 號弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）為導致紅燒肉和醬料包脹袋的產(chǎn)氣微生物，其中8號Citrobacter freundii的產(chǎn)氣量高于其他產(chǎn)氣微生物?？瞻讟悠吩嚬芪串a(chǎn)氣，脹袋紅燒肉、脹袋牛排醬和脹袋番茄醬試管均不同程度產(chǎn)氣，證明試驗的準確性。

表4 微生物產(chǎn)氣驗證實驗結果Table 4 Validation test results of microbial gas production

張小麗等[15]在脹袋醬油中分離純化出巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），確定該菌株是引起產(chǎn)品脹袋的主要產(chǎn)氣微生物。李慧等[16]研究發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是引起牛肉方便菜肴食品脹袋的主要污染源。張懷敏等[17]也確定了芽孢桿菌為老陳醋脹袋的主要產(chǎn)氣微生物。芽孢桿菌在自然條件下極易形成芽孢休眠體，芽孢具有含水量低，抗逆性強和休眠特性等特點，能夠對各種外界脅迫，如高溫、干燥、紫外線、電離輻射以及多種化學物質等具有極強抵抗力，在食品工業(yè)殺菌后仍可存活[18]。殘留在食品中的芽孢在產(chǎn)品的貯藏、運輸和銷售過程中，可能會由于外界環(huán)境的的波動引起食物腐敗變質，導致產(chǎn)品脹袋[19]。綜上所述，芽孢桿菌是引起不同包裝食品脹袋的主要污染微生物，有效控制芽孢污染是解決食品脹袋問題的主要條件之一。

3 結論

本研究以脹袋紅燒肉、脹袋牛排醬和脹袋番茄醬為研究對象，分離鑒定了導致紅燒肉、牛排醬和番茄醬脹袋的產(chǎn)氣微生物。采用多種培養(yǎng)基分離純化出9種脹袋產(chǎn)品中的典型菌落，通過形態(tài)學和分子生物學（16S rDNA）方法進行種屬鑒定，確定2 株革蘭氏陽性球菌，分別為枝狀葡萄球菌（Staphylococcus edaphicus）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）；2 株革蘭氏陰性桿菌，分別為巴氏檸檬酸桿菌（Citrobacter braakii）和弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）；5 株革蘭氏陽性桿菌，分別為魏斯氏菌（Weissella cibaria）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、太平洋芽孢桿菌（Bacillus pacificus）和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。經(jīng)產(chǎn)氣驗證試驗鑒定出引起紅燒肉和醬料包脹袋的產(chǎn)氣微生物為Bacillus velezensis、Citrobacter braakii、Bacillus cereus、Bacillus pacificus和Citrobacter freundi。該結論為脹袋紅燒肉、脹袋牛排醬和脹袋番茄醬中產(chǎn)氣微生物的進一步溯源分析提供了依據(jù)，進而尋找并切斷微生物的確切污染源，保障產(chǎn)品品質，提高食用安全性。