張百剛，李金亮，梁海榮，黃橙輝，徐冬梅

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730050）

嘔吐毒素（vomitoxin）是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）的別稱(chēng)。20 世紀(jì)70 年代是由Yoshizawa 等[1,2]在鐮刀菌污染的小麥和禾谷類(lèi)食物中發(fā)現(xiàn)并鑒定出來(lái)的，它的化合物種類(lèi)屬單端孢霉烯B 族類(lèi)化合物，主要由禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、雪腐鐮刀菌等鐮刀菌產(chǎn)生[3]。DON 的化學(xué)名為3a,7a,l5-三羥基草鐮孢菌-9-烯-8-酮，是最常見(jiàn)的霉菌毒素之一。人和動(dòng)物攝入含DON 的谷物食品會(huì)引起一系列中毒反應(yīng)，例如腹脹、頭昏、嘔吐等一系列的不良反應(yīng)[4]。研究者發(fā)現(xiàn)高劑量的DON 可對(duì)動(dòng)物機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的急、慢性毒性作用。研究表明，急性染毒DON 可導(dǎo)致小鼠肝、腎、脾、胸腺的細(xì)胞損傷[5]，并會(huì)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖作用[6]。國(guó)內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)DON 過(guò)量攝入可引起細(xì)胞毒性、遺傳毒性和免疫毒性[7,8]。雖然DON 的致癌性是不確定的，但對(duì)人體來(lái)說(shuō)具有潛在的危險(xiǎn)性[9]。DON 的細(xì)胞毒性，在人體很多細(xì)胞系中被研究[10]，研究表明在人肝癌細(xì)胞株（HepG2)中證明了DON 對(duì)人體細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的毒性，主要表現(xiàn)為DON 可以抑制細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致細(xì)胞存活率的降低，并且會(huì)誘發(fā)細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)的損傷[11]。

隨著人們對(duì)食品安全的愈加重視，人們對(duì)所食用的谷物及其制品的要求越來(lái)越嚴(yán)格，目前世界很多國(guó)家制定了DON 的限量標(biāo)準(zhǔn)[12]，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布數(shù)據(jù)，DON 已被列為三類(lèi)致癌物。美國(guó)食品及藥品管理局規(guī)定DON 的含量為1 mg/kg 是其安全標(biāo)準(zhǔn)范圍。我國(guó)食品藥品管理局規(guī)定小麥和谷物類(lèi)DON 的含量要求小于5000 μg/kg[13]。然而，超過(guò)此限量會(huì)產(chǎn)生一定的危害，所以研究DON 的毒性作用與毒性機(jī)制，對(duì)保護(hù)食品安全和人類(lèi)健康具有重要意義。雖然研究者對(duì)DON 細(xì)胞毒性做了很多研究工作，但是對(duì)其引起人腎細(xì)胞毒性的研究還很少。本研究通過(guò)探討DON 對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK2 的增殖作用和凋亡蛋白表達(dá)的作用機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步闡明嘔吐毒素的細(xì)胞毒性提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及試驗(yàn)試劑

HK2 細(xì)胞株購(gòu)自蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院儲(chǔ)存庫(kù)；DON（白色粉末、純度≥95%）購(gòu)自阿拉丁生物試劑；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自上海源培生物股份有限公司；青霉素和鏈霉素溶液以及PBS 溶液購(gòu)自北京Solarbio 公司；Hoechst 33328 染色液購(gòu)自南京建成生物試劑；流式細(xì)胞術(shù)試劑購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司；Bax、bcl-2、Caspase-2、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、Caspase-9 單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；牛血清白蛋白（BSA）和Triton X.100購(gòu)自上海Beyotime 公司；LDH 試劑盒、Western 及IP細(xì)胞裂解液均購(gòu)自碧云天公司；LDH 試劑盒堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）均購(gòu)自碧云天公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

MCO-170AICL-PC CO2培養(yǎng)箱，普和希健康醫(yī)療器械有限公司；3-18KS 高速冷凍離心機(jī)，北京博勱行儀器有限公司；Infinite M Nano 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BIO-RAD 公司；CKX53+DP74 熒光倒置顯微鏡，上海劍凌信息科技有限公司；Beckman Altra 流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman 公司；ChemiScope 6100 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；Mini 伯樂(lè)垂直電泳槽，美國(guó)Biorad 公司；Trans blot 伯樂(lè)濕式轉(zhuǎn)移槽，美國(guó)Biorad 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HK2 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，完全培養(yǎng)基（10%的胎牛血清:DMEM=1:9），在5% CO2，37 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 HK2 細(xì)胞增殖試驗(yàn)

將100 μL（4×103cells/孔）HK2 細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，分別加入濃度為0、15、30、40、60 和80 μmol/L 的DON，在37 ℃，含5% CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，向孔板中加入20 μL/孔的MTT，之后在孵育箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后加入150 μL/孔DMSO 溶解液，放在搖床上緩慢搖動(dòng)10 min 至紫色結(jié)晶溶解后，用酶標(biāo)儀在490 nm 處測(cè)定吸光值。每組各設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)平行3 次。

將100 μL（4×103cells/孔）HK2 細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，加入終濃度為30 μmol/L 的DON，在37 ℃，含5% CO2的孵育箱內(nèi)分別培養(yǎng)0、12、24、48、72 和96 h 后，向孔板中加入20 μL/孔的MTT，之后在孵育箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后加入150 μL/孔DMSO 溶解液，放在搖床上緩慢搖動(dòng)10 min 至紫色結(jié)晶溶解后，用酶標(biāo)儀在490 nm 處測(cè)定吸光值。每組各設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)平行3 次。細(xì)胞存活率的計(jì)算公式如下：

式中：

W——細(xì)胞存活率，%；

M——給藥組的OD 值；

M1——對(duì)照組的OD 值。

1.2.3 細(xì)胞凋亡形態(tài)檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK2 細(xì)胞，分別加入濃度為0、15、30、40、60 和80 μmol/L 的DON，在37 ℃，含5% CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，然后加入4%的多聚甲醛300 μL，在室溫下固定15 min。固定完成后，PBS溶液清洗2 次，在搖床上緩慢搖動(dòng)10 min，重復(fù)3 次。室溫避光條件下每孔加入300 μL Hoechst33328 染液，染色5 min。PBS 溶液清洗后，用抗熒光猝滅劑封片，片子避光保存，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 細(xì)胞凋亡率測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK2 細(xì)胞，分別加入濃度為0、15、40 和80 μmol/L 的DON，在37 ℃，含5% CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出，PBS 洗滌細(xì)胞1 次，加入適量的0.25%胰酶消化細(xì)胞，消化完成后吸出胰酶消化液，加入3 mL 新的完全培養(yǎng)基（DMEM:FBS=9:1）到離心管中，1000 g 離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞。按照Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測(cè)。

1.2.5 細(xì)胞中LDH 的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK2 細(xì)胞接種到6 孔板/1000 μL，分別加入濃度為0、15、30、40、60 和80 μmol/L 的DON，在37 ℃，含5% CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，收集上清夜待測(cè)。按照試劑盒的說(shuō)明，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測(cè)定孔和對(duì)照孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)Bax、bcl-2、Caspase蛋白表達(dá)水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，傳代到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長(zhǎng)24 h 后，用濃度為0、15、30 和40 μmol/L的DON 處理細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，按常規(guī)方法提取蛋白。SDS-PAGE電泳，10%分離膠，每孔上樣50 μg 提取的細(xì)胞總蛋白，電泳完畢后經(jīng)電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，室溫封閉1 h。按適當(dāng)比例加入一抗4 ℃搖床過(guò)夜，TBST 洗膜3 次，用TBST 按1:10000 比例稀釋二抗，室溫孵育1.5 h。用Image J 軟件進(jìn)行灰度分析。目的條帶與內(nèi)參條帶的比值作為結(jié)果，各處理組樣品與空白對(duì)照的比值表示蛋白水平。為了實(shí)驗(yàn)結(jié)果有可比性，對(duì)照組值設(shè)為l。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SE）表示。采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。p＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 DON 抑制HK2 細(xì)胞的增殖

不同濃度DON 對(duì)HK2 細(xì)胞的抑制作用如圖1 所示，由圖可知，DON 對(duì)HK2 細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，且隨著濃度增大抑制作用越強(qiáng)。15～80 μmol/L 的DON 對(duì)細(xì)胞的抑制率分別為61.82%、53.64%、42.43%、38.66%和36.54%；30 μmol/L 的DON 處理HK2 細(xì)胞0、12、24、48、72 和96 h 后,細(xì)胞的存活率分別為99.84%、80.51%、60.25%、52.22%、62.50%和71.34%。從細(xì)胞存活率可知，30 μmol/L 處理HK2細(xì)胞48 h 后細(xì)胞毒性達(dá)到最大；但72 h 后細(xì)胞的存活率又有所上升。以上結(jié)果表明，DON 對(duì)HK2 細(xì)胞的抑制作用有一定的量效關(guān)系[14]。

2.2 細(xì)胞形態(tài)的變化

由圖2 的顯微鏡照片可看出，30 μmol/L 的DON可使HK2 細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，與正常細(xì)胞相比，凋亡和死亡比例增大，說(shuō)明DON 對(duì)細(xì)胞有毒性作用，并且造成細(xì)胞損傷。由圖3 的熒光顯微鏡照片可看出，不同濃度DON 作用細(xì)胞后，對(duì)照組染色質(zhì)均勻、無(wú)濃縮、邊集現(xiàn)象，細(xì)胞染色均一，無(wú)明顯亮藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)組核染色質(zhì)明顯聚集、固縮、并且有細(xì)胞核碎片，凋亡小體出現(xiàn)。當(dāng)DON 濃度增大到40 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)凋亡和死亡的比例增大，當(dāng)DON 濃度增大到80 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞幾乎全部凋亡或死亡。

2.3 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)

由圖4 可看出隨著DON 濃度的增大，細(xì)胞凋亡率升高，DON 濃度為15 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞凋亡率為2.30%，當(dāng)DON 濃度增大到40 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞凋亡率為30.20%，當(dāng)DON 濃度增大到80 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞凋亡率為53.50%。由此可說(shuō)明，隨著DON 濃度的增大，細(xì)胞凋亡率不斷升高，DON 對(duì)HK2 細(xì)胞的凋亡有一定的促進(jìn)作用。

2.4 細(xì)胞內(nèi)LDH 的含量

由圖5 可知，DON 對(duì)HK2 細(xì)胞內(nèi)LDH 水平具有一定的影響。隨著DON 濃度增大，細(xì)胞存活率不斷下降，細(xì)胞毒性不斷上升，細(xì)胞內(nèi)LDH 水平不斷下降。當(dāng)DON 濃度為15 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞內(nèi)LDH 含量為對(duì)照組的73.50%。當(dāng)DON 濃度為30 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞內(nèi)LDH 含量為對(duì)照組的61.50%。當(dāng)DON 濃度為40 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞內(nèi)LDH 含量為對(duì)照組36.50%。當(dāng)DON 濃度為60 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞內(nèi)LDH 含量為對(duì)照組的30.90%。當(dāng)DON 濃度為80 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞內(nèi)LDH含量為對(duì)照組的18.20%。這就說(shuō)明，隨著DON濃度增大，細(xì)胞毒性不斷提高，引起細(xì)胞發(fā)生了凋亡或壞死，結(jié)果造成了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，隨后細(xì)胞漿內(nèi)的LDH 釋放到了培養(yǎng)液中。

2.5 DON 對(duì)HK2 細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的影響

2.5.1 不同濃度DON 處理HK2 細(xì)胞對(duì)Bax、bcl-2、NF-KB 蛋白表達(dá)的影響

圖6 結(jié)果表明，Bax 蛋白隨著藥物濃度的增加而上調(diào)；bcl-2 和NF-KB 蛋白表達(dá)下調(diào)。bcl-2 是抗凋亡蛋白，可以抑制蛋白表達(dá)量的增加，與此相反，Bax是促凋亡蛋白，可以促進(jìn)蛋白量的表達(dá)[15]。當(dāng)細(xì)胞被死亡信號(hào)刺激后，相關(guān)蛋白酶作用于促凋亡蛋白，使其構(gòu)象發(fā)生變化，引起細(xì)胞器各種功能的喪失，最終會(huì)引起細(xì)胞器的凋亡[16]。NF-kB 是一種有效的凋亡抑制劑，它會(huì)抑制蛋白與IkB 相結(jié)合，存在于胞質(zhì)中[17]。TNF 誘導(dǎo)時(shí)，IkB 首先被磷酸化，然后被泛素降解。但是，NF-kB 二聚體被釋放，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。這些表達(dá)產(chǎn)物能夠抑制細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的。在DON 加藥誘導(dǎo)后，蛋白表達(dá)量增加，說(shuō)明DON 激活了細(xì)胞內(nèi)NF-kB 的表達(dá)，但是是否直接激活，還需要進(jìn)一步研究。

2.5.2 不同濃度DON處理HK2細(xì)胞對(duì)Caspase家族蛋白表達(dá)的影響

Caspase 屬于半胱氨酸蛋白水解酶的家族，它們各個(gè)成員的作用主要是引起細(xì)胞的凋亡[18]，但是在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中它們扮演著不同的角色。Caspase 凋亡蛋白酶在凋亡過(guò)程中起著不同的作用，研究者將其家族分為兩大類(lèi)：始動(dòng)Caspase 和執(zhí)行Caspase，其中始動(dòng)Caspase 包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9，執(zhí)行Caspase 主要包括Caspase-3、Caspase-6。Caspase被激活后，作用于底物蛋白，使蛋白質(zhì)分解，引起PCD，這類(lèi)酶控制著PCD 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和實(shí)施過(guò)程。圖7 結(jié)果表明，Caspase 凋亡蛋白都隨著DON 濃度增加呈現(xiàn)表達(dá)量上調(diào)的趨勢(shì)，其中Caspase-3 的變化極為明顯，當(dāng)DON 濃度為15 μmol/L 時(shí)，Caspase-3 蛋白表達(dá)量顯著增加（p＜0.001）。當(dāng)DON 濃度為30 μmol/L時(shí)，Caspase-3 蛋白表達(dá)量有一定的增加（p＜0.05）。當(dāng)DON 濃度為40 μmol/L 時(shí)，Caspase-3 蛋白表達(dá)量具有上升趨勢(shì)，無(wú)顯著差異。Caspase-3 是它們成員中參與凋亡的關(guān)鍵酶之一，很多的細(xì)胞凋亡信號(hào)被其激活，使得細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及其細(xì)胞骨架中的重要的蛋白酶失活[13]。

3 結(jié)論

嘔吐毒素可顯著抑制人腎小管上皮細(xì)胞HK2 的增殖作用，并呈現(xiàn)明顯的時(shí)間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系。嘔吐毒素會(huì)使HK2 細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)的改變，進(jìn)而誘導(dǎo)HK2 細(xì)胞發(fā)生凋亡，表現(xiàn)出明顯的凋亡細(xì)胞特征。嘔吐毒素引起了HK2 細(xì)胞內(nèi)LDH 含量的變化，隨著嘔吐毒素濃度增大，細(xì)胞毒性不斷提高，細(xì)胞發(fā)生了凋亡或壞死，結(jié)果造成了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞。嘔吐毒素會(huì)使HK2 細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白表達(dá)水平發(fā)生改變，嘔吐毒素可上調(diào)Bax、Caspase-2、3、6、8、9 蛋白表達(dá)，抑制了bcl-2 和NF-kB 的蛋白表達(dá)。