甘瑞卿，何燕富,2*，李永成,2*，李來好，趙京菁，申鉉日,2，李川,2

（1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南?？?570100）

（2.南海海洋資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口 570100）

（3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東廣州 510300）

近年來，消費(fèi)者對保健食品的需求日益增長，特別是高蛋白食品[1]。水產(chǎn)品加工工業(yè)每年產(chǎn)生許多副產(chǎn)物，其中魚類在加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物包括魚頭、魚鱗、魚皮和內(nèi)臟等副產(chǎn)物。這些副產(chǎn)物大約占據(jù)了整條魚體的40%[2,3]。雖然這些副產(chǎn)物含有潛在生物活性特性的蛋白質(zhì)和一些其他必需營養(yǎng)素，對它們的合理開發(fā)利用將為人類提供豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源[4]，但是這些副產(chǎn)物少部分制成肥料、飼料等[5]，大部分主要作為廢棄物。因此充分利用這些魚類副產(chǎn)物，對于更好的利用水產(chǎn)資源、提高水產(chǎn)魚類加工的附加值和減少加工污染物排放均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

蛋白酶水解可以從不同的樣品中提取蛋白質(zhì)和多肽。這種方法不僅簡單有效、可控制，而且不會產(chǎn)生有毒有害的物質(zhì)[6]，并且在蛋白水解過程中會產(chǎn)生各種滋味活性物質(zhì)，使蛋白酶解液具有各種各樣的滋味。滋味是由非揮發(fā)性的物質(zhì)構(gòu)成的，是魚類產(chǎn)品整體風(fēng)味的重要的組成部分，好的滋味能為消費(fèi)者帶來強(qiáng)烈的消費(fèi)欲望。不同來源的魚副產(chǎn)物、不同的酶制劑和不同的水解條件下獲得的魚蛋白水解物的組分存在差異，因?yàn)椴煌拿钢苿┰趯Φ鞍踪|(zhì)具有不同的酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生不同長度和結(jié)構(gòu)的多肽，因此滋味也存在差異。Yang 等[7]利用復(fù)合蛋白酶水解Takifugu obscurus副產(chǎn)物獲得具有強(qiáng)烈鮮味的多肽，而Fu 等[8]利用木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解牛肌肉得到具有苦味的多肽。過去十年多年，關(guān)于呈味的氨基酸類物質(zhì)的研究較多，特別是禽畜肉類上，但對于酶促蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的非揮發(fā)性關(guān)鍵肽及其貢獻(xiàn)蛋白水解產(chǎn)品的典型味道特征的研究相當(dāng)零碎。

將多肽組學(xué)工具與感官分析結(jié)合起來可能是一種很有前景的研究策略，利用這種方法可以監(jiān)測蛋白酶解過程中關(guān)鍵滋味物質(zhì)的演化，從而闡明蛋白水解物中的鮮味、苦味和其他異味物質(zhì)的來源。本實(shí)驗(yàn)以羅非魚魚皮、魚頭和魚骨為原料，比較探究中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶6 種蛋白酶的水解特性，并應(yīng)用多肽組學(xué)來研究滋味活性肽的來源，為改善魚副產(chǎn)物水解物的滋味提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚（Oreochromis niloticus）副產(chǎn)物（魚頭、魚皮和魚骨）獲取于?？谑醒亟袌?。

中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶河南圣斯德實(shí)業(yè)有限公司。所使用的蛋白酶均為食品級。

鹽酸、氫氧化鈉、乙醇西隴化工股份有限公司；乙腈、三氟乙酸均為色譜級上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；L-亮氨酸上海源葉生物科技有限公司；N-乙酰-l-半胱氨酸（163.19 u），尿苷（224.2 u），抑肽酶（6512 u），細(xì)胞色素（12500 u）和肌紅蛋白（17600 u）標(biāo)準(zhǔn)品上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鄰苯二甲醛混合液（50 mmol/L 鄰苯二甲醛（OPA）、50 mmol/L N-乙酰半胱氨酸、20%十二烷基硫酸鈉、0.1 mol/L 無水四硼酸鈉以體積比2:2:1:15 避光混合并攪拌1 h 后使用）本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

高速組織搗碎機(jī)，美國waring 商業(yè)公司；手持均質(zhì)機(jī)，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；MP511 型實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)，上海三信儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器，常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司；多功能微孔板檢測儀，美國伯騰儀器有限公司；TGL-16M 臺式高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；LC-MS/MS，賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 羅非魚副產(chǎn)物前處理

將三種副產(chǎn)物分別清洗，置于沸水中煮15 min，滅內(nèi)源酶活；再進(jìn)行攪碎、分裝，置于-20±2 ℃貯藏，待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 羅非魚副產(chǎn)物蛋白酶解液的制備

在酶解前，分別取適量的三種羅非魚副產(chǎn)物置于4 ℃冰箱解凍。按固液比1:3（g/mL）加水，冰浴勻漿（8000 r/min，3×30 s），將勻漿好的樣品用1 mol/L 的NaOH 或HCl 溶液調(diào)pH 值至各蛋白酶的最適pH 值，在恒溫水浴震蕩搖床中調(diào)溫度至各蛋白酶的最適溫度，分別按照0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的酶添加量加入不同副產(chǎn)物中，選出各種副產(chǎn)物中不同蛋白酶中的最佳酶添加量后，以最佳的酶添加量制備不同副產(chǎn)物蛋白酶解液，酶解完畢后于100 ℃水浴煮10 min 滅酶，冷卻到室溫，在6000 r/min，4 ℃下離心15 min，收集上清液備用。根據(jù)表1 的蛋白酶最適酶解條件，按相同操作制備出相應(yīng)的蛋白酶解液。

表1 各種蛋白酶的最適酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions of each enzyme

1.3.3 水解度的測定

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取24 支試管分三組，分別加入0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.12、0.16、0.24 mL 5 mg/mL 的L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水補(bǔ)足到1 mL，然后從各個濃度分別取10 μL 于棕色離心管中，分別向其中加入1.2 mL OPA 混合液，震蕩搖勻，靜置10 min 后，于340 nm處測定吸光度。用未加L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的第1 支試管作為空白對照。取三組測定的平均值，以L-亮氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.2 氨基的測定

取10 mL 酶解液加入1.2 mL 的OPA 混合液，避光靜置10 min 后，在波長為340 nm 處測定其吸光值?？偘被渴抢? mol/L HCl 水解蛋白樣品后測定的。按照下式計(jì)算水解度：

式中：

(NH2)x——樣品水解后的氨基含量，mg/mL；

(NH2)0——樣品未水解前的自由氨基含量，mg/mL；

(NH2)總——樣品含有的總氨基含量，mg/mL。

1.3.4 肽分子量分布

利用尺寸排阻色譜測定肽分子量的分布。檢測條件：Agilent 高效液相色譜儀，BioSepSEC-S2000 色譜柱（300×4.6 mm；Phenomenex，USA），洗脫液為20%乙腈水溶液加入0.1%三氟乙酸，流速0.35 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為214 nm。分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品為N-乙酰-l-半胱氨酸（163.19 u），尿苷（224.2 u），抑肽酶（6512 u），細(xì)胞色素（12500 u）和肌紅蛋白（17600 u），校正曲線方程為：

式中：

Mw——分子量，u；

t——洗脫時間，min。

1.3.5 感官評價(jià)

感官評價(jià)根據(jù)Fu 等[8]提出的方法略作修改。感官評價(jià)小組由經(jīng)過篩選和專業(yè)培訓(xùn)的年齡介于20～25 歲之間的8 名感官評價(jià)員所組成，4 名男性，4 名女性。分別以100 mg/mL 咖啡因、100 mg/mL 谷氨酸鈉、50 mg/mL 乳酸和50 mg/mL 氯化鈉作為苦味、鮮味、酸味和咸味四種味覺參比液，對評價(jià)員提前兩個月進(jìn)行感官訓(xùn)練。在室溫（25±1 ℃）條件下，采用九分法來評價(jià)每種酶解液的苦味、鮮味、酸味和咸味，0～3 表示弱、4～6 表示標(biāo)準(zhǔn)和7～9 表示強(qiáng)烈。

1.3.6 LC-MS/MS

1.3.6.1 LC-MS/MS 檢測

每個樣品取1 μL 總肽經(jīng)nano-UPLC 液相系統(tǒng)EASY-nLC1200 進(jìn)行分離后聯(lián)用配備納升離子源的質(zhì)譜儀（Q-Exactive HFX）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。色譜分離采用100 μm ID×15 cm 反相色譜柱（Reprosil-Pur 120 C18-AQ，1.9 μL，Dr.Math）進(jìn)行。流動相采用乙腈-水-甲酸體系，其中流動相A 為0.1%甲酸-98%水溶液（乙腈為2%），B 相為0.1%甲酸-80%乙腈溶液（水為20%）。色譜柱以100%的A 相平衡后，樣品由自動進(jìn)樣器直接上樣到色譜柱，再經(jīng)色譜柱梯度分離，流速300 nL/min，梯度時長120 min。流動相B 比例：2%～5%持續(xù)2 min，5%～22%持續(xù)88 min，22%～45%持續(xù)26 min，45%～95%持續(xù)2 min，95%持續(xù)2 min。質(zhì)譜分析使用數(shù)據(jù)依賴性采集模式，總分析時長為120 min，采取正離子檢測模式。一級掃描范圍350～1600m/z，分辨率為120 k（@ 200m/z），AGC為3e6，最大離子注入時間（max IT）為50 ms；一級掃描中強(qiáng)度最高的20 個離子經(jīng)四極桿篩選后使用HCD 裂解后進(jìn)行碎片離子掃描。四極桿隔離窗口為1.2m/z，標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能為27%，AGC 為1e5，max IT為110 ms。二級掃描分辨率15 k。根據(jù)色譜峰峰寬，動態(tài)排除時間設(shè)為45 s；單電荷及＞6 價(jià)的離子不進(jìn)行二級掃描[9]。

1.3.6.2 搜庫鑒定和蛋白定量

原始數(shù)據(jù)文件首先使用ProteoWizard（version 3.0.18299）軟件轉(zhuǎn)換為mzML 通用文件格式。質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)使用MSFragger3 軟件與對應(yīng)物種水平的數(shù)據(jù)庫序列（uniprot-Oreochromis+Niloticus-8128-2020-10.fasta）進(jìn)行搜庫匹配，主要搜庫參數(shù)采用官方推薦值（詳見philosopher.yaml）。酶切特異性設(shè)為：non-specific；允許多肽長度范圍：7～25；可變修飾包括：15.994915[M]，42.010565[n-term]；[C]無烷基化修飾；母離子質(zhì)量精度：+/-20×10-6；碎片離子精度：+/-20 ppm。MSFragger 搜庫結(jié)果隨后使用Philosopher（v3.3.11）[10]工具集進(jìn)行后續(xù)分析，主要包括PeptideProphet（v5.2.1）用于多肽FDR（1%）控制，ProteinProphet（v5.2.1）用于蛋白FDR（1%）控制，freequant 用于多肽（蛋白）定量分析，IonQuant[11]用于蛋白maxLFQ 定量，最小允許1 對離子比值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的方差分析和顯著性檢驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值，采用Origin 2019b 和GraphPad Prism 8.0 制圖；PCA 雙曲線圖由SIMCA 14.1 繪制，從國際蛋白資源庫（https://www.uniprot.org）中獲得尼羅羅非魚參考蛋白質(zhì)組。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度

OPA 法測定多肽含量的原理是利用氨基與苯二醛之間在340 nm 的波長下發(fā)生熒光反應(yīng)[12]。六種不同蛋白酶對羅非魚的魚皮、魚頭和魚骨的水解程度隨時間的變化曲線如圖1 所示。由圖可見，三種副產(chǎn)物均在風(fēng)味蛋白酶的酶解作用下獲得最高的水解度（p＜0.05），其中魚皮為14.29%（圖1a），魚頭為23.7%（圖1b），魚骨為31.86%（圖1c）。根據(jù)作用機(jī)制和催化位點(diǎn)，蛋白酶分為內(nèi)切酶和外切酶[13]。內(nèi)切酶主要作用于肽鏈的中間位置，而外切酶則主要作用于肽鏈兩端。風(fēng)味蛋白酶同時含有內(nèi)切和外切兩種活性酶，作用位點(diǎn)多，酶解速率高于其他蛋白酶，同時產(chǎn)生較多的游離氨基酸也多于其他蛋白酶[14,15]，這可能解釋了風(fēng)味蛋白酶酶解物水解度顯著高于其他蛋白酶的原因（圖1）；其他五種蛋白酶均為內(nèi)切酶，只作用于肽段中間，缺乏足夠多的端點(diǎn)，而導(dǎo)致酶解物的水解度低。茼玉婷和叢艷君[16]在利用風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶等六種商業(yè)酶水解草魚內(nèi)臟蛋白的研究中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過風(fēng)味蛋白酶水解的酶解液中富含氨基酸；而Zahra等[17]采用堿性蛋白酶和風(fēng)味酶對虹鱒皮進(jìn)行水解，風(fēng)味酶水解物得到較高的水解度，與羅非魚副產(chǎn)物所得結(jié)果相一致。

2.2 感官評價(jià)

為了研究蛋白質(zhì)水解物與感官屬性之間的關(guān)系，進(jìn)行了主成分分析（PCA）（圖2）。羅非魚魚皮蛋白水解物的PCA 圖表示，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）貢獻(xiàn)率分別為50.7%和47.1%（圖2a）。經(jīng)過中性蛋白酶處理的魚皮蛋白水解液具有標(biāo)準(zhǔn)鮮味（3.88）和弱酸味（2.38），而經(jīng)過木瓜蛋白酶處理的蛋白酶解液有標(biāo)準(zhǔn)苦味（4.36）。圖2b 顯示了羅非魚魚頭蛋白水解度的主成分分析結(jié)果（PC1=65.5%和PC2=34%）。經(jīng)過堿性蛋白酶處理的蛋白酶解液呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)鮮味（3.88），經(jīng)過中性蛋白酶處理的蛋白酶解液有苦味（4.25）。如圖2c 所示，羅非魚魚骨水解物的主成分分析結(jié)果顯示，PC1 和PC2 的貢獻(xiàn)率分別為53.8%和31.5%。菠蘿蛋白酶處理的蛋白水解液的鮮味強(qiáng)度最高（6.88），木瓜蛋白酶處理的水解物有標(biāo)準(zhǔn)苦味（4.88）和弱酸味（2.0）。值得注意的是，木瓜蛋白酶在三種蛋白水解液中產(chǎn)生不良滋味（包括酸味和苦味），堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶分別在魚頭和魚骨中產(chǎn)生了鮮味，而中性蛋白酶在魚皮蛋白水解液中產(chǎn)生了鮮味，但在魚頭蛋白水解液卻產(chǎn)生了苦味。

蛋白酶解液的感官屬性與水解度有關(guān)，尤其與含有疏水氨基酸的低分子量肽的含量有關(guān)[13,18]。而這種低分子量肽的產(chǎn)生取決于所使用的酶和底物[19,20]。木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶均為巰基蛋白酶，這兩者的區(qū)別在于木瓜蛋白酶的活性位點(diǎn)具有廣泛的底物特異性，包括水解蛋白質(zhì)和多肽中精氨酸和賴氨酸的羧基末端，表明它可以釋放苦味氨基酸，如精氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸；而菠蘿蛋白酶活性部位不具有特異性，這可能是木瓜蛋白酶產(chǎn)生酸苦味而菠蘿蛋白酶水解的酶解液產(chǎn)生鮮味的原因。同一蛋白酶的不同結(jié)果可能是由于底物特異性[13]。Maehashi 等[20]曾報(bào)道，同一種酶可以在不同水解物中產(chǎn)生不同的味道。這與我們得出中性蛋白酶在不同樣品中產(chǎn)生不同滋味的結(jié)果相同。

2.3 肽分子量分布

圖3 為羅非魚魚皮、魚頭和魚骨的肽分子量的分布。三種魚副產(chǎn)物的肽分子量主要分布在1000～5000 u（60%）和500～1000 u（30%），這表明魚副產(chǎn)物中的大部分蛋白質(zhì)被水解成肽（圖3a～c）。從圖3a 可以看出，三種副產(chǎn)物中魚皮產(chǎn)生較多的大分子肽，這可能是因?yàn)轸~皮中含有較多膠原蛋白，使之較難水解[21]。研究表明，苦味肽[22,23]和鮮味肽[8]等滋味肽主要來源于小分子肽。

三種副產(chǎn)物經(jīng)過風(fēng)味蛋白酶酶解的蛋白水解液中小于1000 u 的肽含量最多，這與水解度中風(fēng)味蛋白酶獲得最高的水解度的結(jié)果相符合。然而，在風(fēng)味蛋白酶的水解液中，鮮味、酸味和苦味等滋味不突出?？梢越忉屵@個現(xiàn)象的原因有二：一是可能是因?yàn)轷r味、甜味或咸味等滋味對苦味有一定的掩蓋作用，如鮮味肽可以通過苦味受體抑制苦味[24]，導(dǎo)致蛋白酶解液的滋味不顯著；二是因?yàn)檫@些蛋白水解液中含有較少的滋味活性肽，使蛋白酶解液的滋味不突出。因此，對中性蛋白酶和木瓜蛋白酶在魚皮水解產(chǎn)生的滋味特性，堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對魚頭水解的滋味特性，菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶對魚骨水解的滋味特性進(jìn)行了進(jìn)一步的探究。

2.4 潛在滋味活性肽的鑒定

圖4表示采用LC-MS/MS鑒定從三種魚副產(chǎn)物的酶解液中挑選出來具有不同滋味的蛋白酶解液中肽的組成。從魚皮蛋白酶解中一共鑒定出5833 個肽，其中在具有鮮味和酸味的酶解液中鑒定出2106 個肽，而在具有苦味的酶解液中鑒定出3727 個肽；從魚頭蛋白酶解液中共鑒定出8952 個肽，其中具有鮮味的酶解液中鑒定出1828 個肽，具有酸味的酶解液中鑒定出3050個肽，具有苦味的酶解液中鑒定出4074 個肽；從魚骨蛋白酶解液中共鑒定出6888 個肽，其中具有鮮味的酶解液中鑒定出2586 個肽，具有苦味和酸味的酶解液中鑒定出4074 個肽（圖4a）。分別從這些鑒定出來的肽中篩選三種副產(chǎn)物中共有的肽為潛在的滋味肽，分別得到66 個潛在鮮味肽、271 個潛在酸味肽和308 個潛在苦味肽（圖4b）。

如圖4c 所示，潛在的鮮味肽的肽段長度主要集中在9～13 個氨基酸（68.18%）；潛在的酸味肽和苦味肽主要集中在10～14 個氨基酸（64.21%和60.06%）。肽段的結(jié)構(gòu)和序列長度會影響其滋味特性，肽段序列長度越長對滋味的影響越大。先前有研究報(bào)道，鮮味肽（包括鮮味增強(qiáng)肽）的肽段長度主要集中在2～15 個氨基酸[25-27]，然而苦味肽主要集中在2～8 個氨基酸[22,28,29]。當(dāng)苦味肽中含有8 個或8 個以上的氨基酸的苦味效果與8 個以下氨基酸構(gòu)成的苦味肽相差不大

[30]。這些結(jié)果與以前的研究結(jié)果相一致。

滋味活性肽是一種與滋味有關(guān)的寡肽，其分子量小于3000 u[31]由圖4d 可見，鑒定出來的潛在滋味活性肽的分子量均在3000 u 以下，而大部分的肽的分子量在1000～1500 u。潛在的鮮味肽的分子量范圍小于1500 u，而潛在的苦味肽和酸味肽的分子量范圍小于2000 u。據(jù)相關(guān)報(bào)道，鮮味肽的分子量均小于或等于1000 u[31,32]；然而，苦味肽與分子量之間的關(guān)系尚不明確[14,15]。Cheung[33]的研究表明蝦酶解液中的肽在3000 u 時，苦味最大；同樣有研究表明分子量在1900～3300 u 之間的肽是高苦肽段，而較大或較小分子量的肽段則表現(xiàn)出溫和的苦度[34]。至于酸味肽，其分子量與滋味強(qiáng)度之間的關(guān)系尚不明確，仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.5 蛋白酶酶切特異性

利用LC-MS/MS 確定了三種潛在滋味肽的序列特異性。主要分析四個位置的酶切位點(diǎn)：N 端第二個氨基酸（P2’），N 端第一個氨基酸（P1’），C 端第一個氨基酸（P1），C 端第二個氨基酸（P2）。根據(jù)酶的特異性，不同的酶可以產(chǎn)生不同類型的肽[35]。通常認(rèn)為肽段的C端處含有親水性的氨基酸殘基會產(chǎn)生較好的滋味，而含有疏水性的氨基酸如苯丙氨酸和纈氨酸會增加苦度[36]。在三種滋味活性肽中，P1 和P1’的位置主要均以異亮氨酸和丙氨酸為主（圖5）。對比三種滋味活性肽的酶切位點(diǎn)可以發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸出現(xiàn)在潛在滋味肽的頻率高于其他兩種。蛋氨酸作為含硫氨基酸雖然本身不會產(chǎn)生肉味，但對酶解液風(fēng)味的形成具有重要作用[37]。圖5a 表明，三種內(nèi)肽酶（中性蛋白酶、堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶）在P1 和P1’處有對不帶電荷的非支鏈殘基有優(yōu)先裂解作用，并且可以發(fā)現(xiàn)潛在苦味肽和酸味肽具有相似的酶切位點(diǎn)（圖5b 和5c）。這與感官評價(jià)結(jié)果相一致。并且，三種潛在的滋味肽兩端的氨基酸殘基均為疏水性。多肽的苦味與肽中是否存在親水性基團(tuán)和堿性氨基酸殘基有關(guān)，并認(rèn)為親水性基團(tuán)與疏水性基團(tuán)在空間相距0.3 nm 時便會產(chǎn)生苦味[34]。有報(bào)道鮮味肽中含有疏水性氨基酸，而這些疏水性氨基酸通常是與苦味肽有關(guān)的[38]。從文蛤中鑒定并合成的鮮味多肽和鮮味增強(qiáng)肽的肽段序列中含有較多疏水性氨基酸[27]；Ruan 等[39]從羅非魚下顎中提取了五個鮮味肽，其氨基酸序列中多數(shù)為疏水性氨基酸。因此，羅非魚副產(chǎn)物蛋白水解滋味肽可能與疏水性氨基酸有關(guān)，并且蛋氨酸可能在有鮮味的酶解液中起到重要作用。

2.6 前體蛋白

圖6a 為鑒定的與潛在滋味活性肽相關(guān)的前體蛋白，圖6b 表示潛在鮮味肽的前19 個前體蛋白，圖6c和圖6d 分別表示潛在酸味肽和苦味肽的前20 個前體蛋白。膠原蛋白和肌原纖維蛋白，特別是肌動蛋白、肌鈣蛋白和肌球蛋白等是潛在滋味活性肽的主要來源蛋白。另外，肌漿蛋白，如2-磷酸-D-甘油酸水解酶和L-乳酸脫氫酶等同樣對對滋味肽作出貢獻(xiàn)（圖6b～6d）。

先前有研究報(bào)道與滋味有關(guān)的氨基酸或者小肽可能是肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的水解產(chǎn)物[29,40]并且由肌鈣蛋白T 產(chǎn)生的多肽可以促進(jìn)牛肉味的產(chǎn)生[41]。然而，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的蛋白水解也會導(dǎo)致不良的滋味[42]。這說明肌漿蛋白和肌原纖維蛋白是蛋白酶解液中各種滋味的主要來源蛋白。在目前的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)滋味活性物質(zhì)不僅來源于肌漿蛋白和肌原纖維蛋白，而且也有可能來源于膠原蛋白。但是膠原蛋白與滋味活性物質(zhì)之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步探究。

3 結(jié)論

采用六種商業(yè)酶來水解羅非魚三種副產(chǎn)物（魚皮、魚頭和魚骨）選出具有代表性滋味的酶解液，通過LC-MS/MS 分析羅非魚副產(chǎn)物的滋味來源。結(jié)果表明魚皮、魚頭和魚骨分別經(jīng)過風(fēng)味蛋白酶酶解的水解度最高，分別為14.29%、23.7%和31.86%。魚皮經(jīng)過中性蛋白酶處理的酶解液具有顯著鮮味和弱酸味，經(jīng)過木瓜蛋白酶處理的酶解液具有苦味；魚頭經(jīng)過堿性蛋白酶處理的酶解液具有顯著鮮味，經(jīng)過中性蛋白酶處理的具有苦味，經(jīng)過木瓜蛋白酶處理的具有酸味；魚骨經(jīng)過菠蘿蛋白酶處理的酶解液具有強(qiáng)顯著鮮味，經(jīng)過木瓜蛋白酶水解的具有顯著苦味。羅非魚副產(chǎn)物蛋白酶解液中潛在滋味肽主要是由膠原蛋白、肌漿蛋白和肌原纖維蛋白降解得到，其分子量小于1500 u，疏水性氨基酸在這些潛在滋味肽中起重要作用，其中蛋氨酸對鮮味酶解液作出重要貢獻(xiàn)。