程 潔 王 倩 李自昂 勞垚佳 黃 凱 牟娟麗 林 軍

武漢大學(xué)中南醫(yī)院消化內(nèi)科 湖北 武漢 430071

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）已成為全球惡性腫瘤第3 位死亡病因，對人類的健康造成了極大的威脅［1，2］，并日漸呈現(xiàn)“年輕化”的發(fā)病趨勢［3］。目前臨床篩查所用糞便隱血測試（fecal occult blood test，F(xiàn)OBT）特異性不強，而作為診斷金標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)腸鏡受侵入性、檢查前腸道準(zhǔn)備、價格昂貴等因素影響，導(dǎo)致患者依從性較差。因此，探尋早期篩查CRC 的無創(chuàng)、非侵入性生物標(biāo)記物成為目前研究的熱點問題。

組織因子途徑抑制劑2（tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI2）屬于kunitz 型絲氨酸蛋白酶抑制劑，被認為是一種腫瘤抑制因子，主要通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)發(fā)揮作用［4］。在多種惡性腫瘤中均具有顯著的抑癌作用［5，6］。DNA 啟動子甲基化引發(fā)的表觀遺傳基因沉默在CRC 的發(fā)生及發(fā)展中起著重要的致病作用［7］，并與CRC 不良預(yù)后密切相關(guān)［8，9］。研究證實CRC 存在TFPI2 甲基化，但相關(guān)的研究較少，在結(jié)直腸腺瘤中的研究更是少見，且大部分研究樣本數(shù)量有限，導(dǎo)致最終的驗證結(jié)果參差不齊［10，11］。本 研 究 通 過Meta 分 析 的 方 法 評 估TFPI2基因甲基化在CRC 及結(jié)直腸腺瘤中的診斷作用，進一步強調(diào)其臨床非侵入性、無創(chuàng)的篩查診斷價值。

1 資料與方法

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）研究內(nèi)容為評估TFPI2 甲基化在人CRC 中的診斷價值；（2）研究設(shè)計明確，分為病例組與對照組；（3）病例組中CRC 診斷明確，且以腸鏡病理結(jié)果為診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”；（4）可從研究結(jié)果中提取出CRC 患者TFPI2 基因甲基化情況的真陽性（true positive，TP）、真陰性（true negative，TN）、假陽性（false positive，F(xiàn)P）、假陰性（false negative，F(xiàn)N）等數(shù)據(jù)以構(gòu)建2×2 四格表。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）非人體相關(guān)研究；（2）樣本例數(shù)小于10 例；（3）無完整數(shù)據(jù)構(gòu)建2×2 診斷四格表；（4）會議論文摘要、綜述、講座、病例報告、專家意見和評論等；（5）重復(fù)文獻；（6）中文和英文以外其他語種寫作的文獻。

1.2 文獻篩選在Pubmed、Cochrane Library、EMBASE、Web of Science、Wanfang、CNKI、VIP、CBM 等數(shù)據(jù)庫中檢索TFPI2 基因甲基化與CRC 的相關(guān)研究，時間范圍設(shè)定為數(shù)據(jù)庫創(chuàng)建開始至2021年2 月5 日截止。中文檢索詞有：大腸癌、大腸腫瘤、TFPI2、組織因子途徑抑制物2、甲基化、DNA 甲基化等。英文檢索詞包括：Colorectal neoplasms、Colorectal tumor、TFPI2、Methylation*、Hypermethylated 等，并檢索二次文獻進行補充。

1.3 檢索文獻質(zhì)量評價由2 位研究者獨立進行文獻檢索并對篩選所得文獻進行質(zhì)量評價，質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)為診斷準(zhǔn)確性研究質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)-2 量表［12］，基于每部分中相關(guān)的標(biāo)志性問題做出“是”、“否”或“不確定”的判斷，若2 人的判斷存在差異則由第三人加入共同探討完成。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析使用RevMan 5.2 軟件完成篩選文獻質(zhì)量評價；利用Stata 12.0 計算合并靈敏度、特異度、陽性似然比（positive likelihood ratio，PLR）和陰性似然比（negative likelihood ratio，NLR）、診斷比值比（diagnostic odds ratio，DOR）等數(shù)據(jù)，并繪制森林圖及匯總受試者工作特征曲線（summary receiver operating characteristic，SROC），計算曲線下面 積（area under the curve，AUC）；若I2＞50%，P＜0.05 被認為存在異質(zhì)性，可采用隨機效應(yīng)模型；利用MetaDisc 1.4 計算Spearman 相關(guān)系數(shù)，檢驗有無閾值效應(yīng)，最后，進行敏感性分析、Meta 回歸、亞組分析等，尋找異質(zhì)性的原因。繪制Deek's 漏斗圖評估發(fā)表偏倚，P＜0.1 表示存在發(fā)表偏倚。

2 結(jié)果

2.1 文獻檢索結(jié)果共檢索到文獻150 篇，包括中文文獻41 篇、英文文獻109 篇，排除重復(fù)文獻44 篇；精讀39 篇文獻全文，排除28 篇不符合納入標(biāo)準(zhǔn)文獻，其中9 篇缺乏完整的四格表信息，5 篇為非人體研究，1 篇樣本量小于10 人，12 篇為綜述、Meta 分析或個案報道，1 篇未找到全文。最終納入文獻11 篇，其中中文文獻5 篇、英文文獻6 篇，包括788 例CRC、422 例結(jié)直腸腺瘤患者和360 例正常人。

2.2 納入文獻基本特征及質(zhì)量評估納入的11 篇文獻的基本特征［13-23］見表1，有1 篇文獻同時進行了糞便及組織的TFPI2 基因甲基化檢測，將其分為“a”、“b”。其中10 篇文獻使用了甲基化特異性PCR（MSP）或定量甲基化特異性PCR（qMSP）檢測，僅有1 篇使用定量等位基因特異性實時靶向和信號擴增（QuARTS）的檢測方法；有5 篇研究類型屬于橫斷面研究，另外6 篇為病例對照研究。在篩選的11篇文獻中有8 篇文獻中同時進行了結(jié)直腸腺瘤的TFPI2 基因甲基化檢測，并可以提取出2×2 四格表。由于納入的部分研究為病例對照研究，因此僅在病例選擇及待評價試驗中存在部分的高風(fēng)險，整體文獻質(zhì)量評價水平較高。

表1 TFPI2 甲基化診斷結(jié)直腸癌及結(jié)直腸腺瘤納入文獻的基本特征

2.3 診斷準(zhǔn)確性評價Meta 分析結(jié)果顯示（圖1～2），TFPI2 基因甲基化診斷CRC 的合并靈敏度為0.82（95%CI：0.67～0.92）、特 異 度 為0.96（95%CI： 0.86～0.99） 、PLR 19.68 （95%CI：5.61～68.98）、NLR 0.18（95%CI：0.09～0.37）、DOR 107.13 （95%CI： 23.48～488.87），AUC0.96（95%CI：0.94～0.97）。診斷結(jié)直腸腺瘤的合并靈敏度0.62（95%CI：0.42～0.79）、特異度0.94（95%CI： 0.83～0.98） 、PLR 10.34 （95%CI：2.81～38.02）、NLR 0.40（95%CI：0.23～0.70）、DOR 25.84（95%CI：4.41～151.28），AUC0.89（95%CI：0.86～0.92）。適用性評價Fagan 圖（圖3左）提示患者TFPI2 甲基化檢測CRC 的驗后陽性預(yù)測值為85%，相比于驗前明顯提高；似然比點圖（圖3 右）結(jié)果提示大部分文獻均具有診斷價值，診斷的特異度較靈敏度更強。

圖1 TFPI2 基因甲基化評估結(jié)直腸癌(左)和結(jié)直腸腺瘤(右)的靈敏度和特異度森林圖

圖2 TFPI2 基因甲基化評估結(jié)直腸癌（左）及結(jié)直腸腺瘤（右）的SROC 曲線

圖3 TFPI2 甲基化診斷結(jié)直腸癌的適用性評價Fagan 圖（左）和似然比點圖（右）

2.4 診斷異質(zhì)性分析本研究分析中I2為98.05%（95%CI：97.52～98.57），靈敏度的Q檢驗得到P＜0.05，說明納入的研究存在異質(zhì)性。Spearman 相關(guān)系數(shù)為0.067，P=0.837，提示不存在閾值效應(yīng)。敏感性分析結(jié)果：將納入的11 篇文獻依次剔除后，整體的合并效應(yīng)量及I2無顯著變化，均具有較高的診斷價值，表明納入的研究診斷穩(wěn)定性較好。在剔除文獻李海軍等［22］的研究后整體的DOR 及AUC達到最大，DOR 為151.50（95%CI：35.46～647.27），AUC為97%。

在此基礎(chǔ)上進行Meta 回歸分析，進一步分別從研究種族、納入研究質(zhì)量、發(fā)表年限、實驗設(shè)計、樣本類型及檢測方法幾個方面探尋異質(zhì)性的來源。在Meta 回歸分析中，種族和樣本類型是診斷靈敏度異質(zhì)性的主要來源（P＜0.05，P＜0.001），而對于診斷特異度，文獻發(fā)表年限是異質(zhì)性的主要來源（P＜0.05），不排除可能存在其他影響異質(zhì)性的原因未被提取。

進一步根據(jù)Meta 回歸結(jié)果進行亞組分析（表2），同時納入樣本類型、種族及發(fā)表年限進行分組，所有的分組中均提示TFPI2 具有較高的診斷價值。然而，相比于組織的TFPI2 甲基化，血清和糞便也具有一定的診斷能力，DOR 為60.69（95%CI：9.02～408.58），AUC為89%；與此同時，在血清和糞便等無創(chuàng)檢測的分組中也存在更大的異質(zhì)性（I2=97.49%）。在種族分組中顯示，盡管TFPI2 基因甲基化診斷CRC 在大部分人群中均具有較高的診斷價值，但在非亞洲人中更占有優(yōu)勢，DOR 為［347.99（95%CI：70.50～1 717.66）vs54.46（95%CI：8.96～331.06）］，AUC為（96%vs91%），同時也可以明顯降低異質(zhì)性（I2=88.88%）。而文獻發(fā)表年份的亞組分析則提示，盡管2015 年以前發(fā)表文獻的診斷能力更強，但其可能是研究的異質(zhì)性來源，而2015 年后發(fā)表文獻仍顯示出一定的診斷價值，并可以明顯降低異質(zhì)性（I2=90.31%）。

表2 TFPI2 甲基化診斷結(jié)直腸癌的亞組分析

2.5 發(fā)表偏倚繪制發(fā)表偏倚Deek's 漏斗圖，各研究分布較均勻，統(tǒng)計結(jié)果提示P=0.26，表明本研究納入的文獻中不存在顯著的發(fā)表偏倚。

3 討論

生物標(biāo)記物是CRC 患者早期診斷及制定個體化治療方案的重要指征，不僅可以協(xié)助早期識別CRC 癌前病變，同時可以預(yù)測疾病的進展。研究結(jié)果表明FOBT 診斷CRC 的敏感性為73.8%，特異性僅為23.8%［24］，盡管如此，由于其無創(chuàng)便捷的方式、低廉的價格，仍然為臨床上早期篩查CRC 的重要方式。表觀遺傳標(biāo)記的研究發(fā)現(xiàn)，以啟動子CpG島甲基為主的表觀遺傳學(xué)變化在CRC 中發(fā)生頻率高，探討以組織、血液、糞便等作為載體的基因甲基化表現(xiàn)出極大的診斷潛力。目前血液SEPT9［25］以及糞便VIM［26］基因甲基化以其較高的診斷價值已初步實現(xiàn)診斷試劑的商品化。生物信息學(xué)分析表明，TFPI2 啟動子甲基化是CRC 中的早期事件［27］，同時，其甲基化程度和CRC 惡性程度、腫瘤浸潤深度、遠處轉(zhuǎn)移等不良事件相關(guān)，還可用于評估CRC術(shù)后有無殘余，表明TFPI2 甲基化在CRC 中具有較高的研究價值。本研究據(jù)此基礎(chǔ)上收集TFPI2基因啟動子甲基化對CRC 診斷的相關(guān)研究，在了解目前研究現(xiàn)狀的同時，綜合評估其診斷能力。

結(jié)直腸腺瘤是CRC 發(fā)展的早期階段，因此研究TFPI2 甲基化診斷結(jié)直腸腺瘤，可凸顯CRC 癌前病變篩查診斷、早防、早查，以及后續(xù)早治價值。結(jié)果顯示TFPI2 基因甲基化對診斷CRC 的合并靈敏度為0.82、合并特異度為0.96、AUC達到96%，與Rasmussen 等［28］的研究結(jié)果相符，提示TFPI2 甲基化存在具有檢測早期或惡性病變中的CRC 的潛力，還可作為腫瘤復(fù)發(fā)的指標(biāo)。此外，在克羅恩病［29］、潰瘍性結(jié)腸炎［13］也檢測到TFPI2 基因的甲基化，而長期慢性炎癥是良性腫瘤向惡性腫瘤過渡的重要因素。由此可見，TFPI2 基因甲基化在CRC 發(fā)生發(fā)展過程中普遍存在，包括結(jié)直腸腺瘤之癌前病變、早癌等早期檢查、早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷中尤為重要。

進一步通過敏感性分析、Meta 回歸及亞組分析的方式探尋本研究中異質(zhì)性的來源。亞組分析發(fā)現(xiàn)，血液及糞便中TFPI2 的甲基化診斷DOR 可以達到60.69（95%CI：9.02～408.58），AUC為89%，再次驗證其診斷價值較高，與此同時，也顯示較高的異質(zhì)性。近年來，有關(guān)血液及糞便基因甲基化的診斷研究層出不窮，大量的文獻資料［30，31］提示糞便或血液中基因的甲基化擁有無創(chuàng)、便捷、迅速、高特異度等特點，或成為今后CRC 篩查的重要研究手段，本研究結(jié)果同樣提示了在血清及糞便中TFPI2基因甲基化對CRC 的診斷能力較好。因此，以此為基礎(chǔ)的多基因甲基化篩查來提高CRC 診斷的靈敏度和特異度或成為今后的研究趨勢之一，而較高的異質(zhì)性則提示仍然需要更多的高質(zhì)量研究進一步證實該研究手段的診斷價值。

此外，Meta 回歸及亞組分析均提示TFPI2 甲基化在非亞洲人中具有更高的診斷價值。由于DNA甲基化水平不僅受到胚胎發(fā)育的早期影響，還會受到外界環(huán)境等多種因素的調(diào)控，因此基因易感性的不同使其在種族中存在明顯差異［32］。一項在CRC中尋求全面甲基化標(biāo)記的研究中提到，TFPI2 基因甲基化在非亞洲人（美國白人）中的甲基化檢出率明顯高于亞洲人（日本和韓國人）［33，34］，和我們的研究結(jié)論不謀而合。而文獻發(fā)表年限的亞組分析則提示，盡管2015 年前發(fā)表的文獻具有更高的診斷價值，但同時也擁有更高的異質(zhì)性（I2=98.52）。我們推測可能與2015 年前后文獻中試驗所用試劑盒差異、以及少部分文獻進行了年齡、性別、腫瘤分期的相關(guān)分析等因素有關(guān)。然而，由于文獻中闡述不充分及原始資料的缺失，我們無從進一步考證。

研究結(jié)果表明TFPI2 對結(jié)直腸腺瘤、尤其是CRC 診斷存在一定價值。同時，本研究也存在局限性：（1）本研究納入文獻研究類型均為橫斷面研究及病例對照研究，缺乏高質(zhì)量的隨機對照試驗；（2）納入的研究中不排除研究者傾向于陽性發(fā)表可能，因而部分陰性結(jié)果未能得以檢索；（3）納入的研究單個樣本量仍然較小，需要更多大樣本多中心的研究，同時可進一步研究TFPI2 基因甲基化與CRC預(yù)后和復(fù)發(fā)的相關(guān)性；（4）本文只納入了組織、血清及糞便的研究，而未發(fā)現(xiàn)有其他體液（如：尿液或腸液等）研究，可為今后的研究方向提供新思路。

綜上所述，TFPI2 基因甲基化對CRC 具有較高的診斷價值，同時對早期結(jié)直腸腺瘤也存在一定的診斷能力，有必要通過大樣本、多中心的研究，為今后深入的機制研究或臨床轉(zhuǎn)化提供更多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。