藍林輝 王志維

武漢大學人民醫(yī)院心血管外科 湖北 武漢 430060

急性Stanford A 型主動脈夾層是一種十分危重的急性主動脈綜合征疾病，盡管它能通過手術以及混合血管內技術進行治療，但是死亡率和發(fā)病率仍然 很 高［1］。主 動 脈 平 滑 肌 細 胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）在維持血管結構中起關鍵作用，是心血管系統(tǒng)的重要組成部分，其表型轉化與主動脈夾層的進展關系密切；轉化生長因子(transforming growth factor，TGF）-β1 已被證明能夠誘導主動脈平滑肌表型轉化，促進VSMC 的增殖遷移，從 而 使 收 縮 型VSMC 轉 化 為 合 成 型VSMC［2］。有研究顯示，TGF-β1 被測定為叉頭框蛋白P1（forkhead box protein p1，F(xiàn)oxp1）在內皮細胞（ECs）中的直 接 下 游 靶 基 因，F(xiàn)oxp1 能 通 過 調 節(jié)TGF-β1 抑 制病理性心臟重塑［3］；然而還未有相關實驗對Foxp1在主動脈夾層中的作用進行研究，故本實驗通過檢測Foxp1 在主動脈夾層主動脈壁中的表達以及Foxp1 對TGF-β1 誘導的VSMC 表型轉化的調控作用這兩個方面來進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主動脈壁以及VSMC 的獲取 主動脈標本分為正常組和夾層組；夾層組標本來自武漢大學人民醫(yī)院2019 年6 月—2020 年6 月凍存的急性Stanford A 型主動脈夾層患者術中切除的升主動脈壁，隨機選取10 例；正常組標本來自同期我院凍存的心臟移植捐贈者的升主動脈壁，隨機選取5 例。VSMC 提取自原代大鼠主動脈血管平滑肌細胞。

1.1.2試 劑 TGF-β1（InvivoGen）；Foxp1 質 粒（武漢科鹿生物科技有限公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（HyClone）；胎牛血清（杭州天杭生物科技有限公司）；PBS、青霉素-鏈霉素溶液（100×）（吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司）；胰酶-EDTA（吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司）；三氯甲烷、無水乙醇、異丙醇（國藥集團化學試劑）；Lipofectamine（ThermoFisher）；GAPDH（ab181602）、α-SMA（ab124964）、SM22α（ab14106）、骨橋蛋白（OPN；ab63856）（Abcam）；Foxp1（#4402）（CST）；HRP-Goat anti Rabbit（AS1107）、HRPRabbit anti Goat（AS1108）、HRP - Goat anti Rat（AS1093）、HRP-Rabbit anti Sheep（AS1245）、BCA蛋白質濃度測定試劑盒（AS1086）、RIPA 總蛋白裂解液（AS1004）（ASPEN）。

1.2 方法

1.2.1大鼠主動脈血管平滑肌細胞原代培養(yǎng) 參考文獻［4］方法進行VSMC 原代培養(yǎng)。無菌條件下迅速分離大鼠主動脈，分離過程中避免損傷食管與肺組織，將主動脈轉移到培養(yǎng)皿中，PBS 清洗1 遍，無菌眼科鑷剝離血管外膜，顯微剪縱行剪開血管，眼科彎鑷刮除血管內皮細胞。顯微剪將中膜剪成1 mm3大小碎片，均勻鋪平于6 cm2細胞培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)箱放置30 min，使組織塊緊貼皿底，加入5 mL 含20%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基，放入37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d 換液一次，當細胞生長達到亞融合狀態(tài)（約80%融合）時，去除組織塊，用0.25%胰酶消化細胞，進行傳代培養(yǎng)，傳代至3代后按照需要進行細胞干預及后續(xù)實驗。

1.2.2Foxp1 質粒轉染VSMC （1）轉染前1 d，每孔（6 孔板）5×105細胞接種于2 mL 培養(yǎng)基中。（2）用250 μL Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基將Plasmid 稀釋至濃度50 nmol/L，室溫下孵育5 min。（3）用250 μL Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基稀釋5 μL Lipofectamine 2000，室溫下孵育5 min。（4）稀釋的Plasmid 和Lipofectamine 2000 混合，室溫下放置20 min。（5）將500 μL 轉染液和1 500 μL 基礎培養(yǎng)基加入每孔中。（6）37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h 后換完全培養(yǎng)基。24 h 后使用倒置顯微鏡觀察轉染效果，將轉染結果以圖片記錄。

1.2.3VSMC 不同處理 將體外培養(yǎng)的細胞（每孔1.5 mL）接種在6 孔板中，將細胞分為3 組。（1）+TGF-β1 組：VSMC 放入添加5 ng/mL TGFβ1 的 完 全 培 養(yǎng) 基 中 培 養(yǎng)24 h；（2）Foxp1 質 粒 組：VSMC 轉染Foxp1 的重組質粒，完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；（3）Foxp1 質 粒+TGF-β1 組：VSMC 轉 染Foxp1 的重組質粒，放入添加5 ng/mLTGF-β1 的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。空白對照組：VSMC 不做特殊處理，完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；每組設6 孔。

1.2.4RT-PCR 和Western Blot 檢測 收集主動脈壁組織勻漿，RT-PCR 和Western Blot 方法檢測其Foxp1、TGF-β1、α-SMA、SM22α、OPN 的mRNA和蛋白的表達情況；收集培養(yǎng)的各組細胞，RT-PCR和Western Blot 方 法 檢 測 其Foxp1、α - SMA、SM22α、OPN 的表達情況。PCR 引物序列：Foxp1上游引物，5'-TCTACAGAACCCAAAGCTGCC-3'，下 游 引 物，5'-TGTATTTGTCTGAGTACCGCCTG-3'；TGF-β1 上 游 引 物，5'-GTGGCTGAACCAAGGAGACG-3'，下 游 引 物，5'-AGGTGTTGAGCCCTTTCCAG-3'；α-SMA 上 游 引 物，5'-AGCATCCGACCTTGCTAACG-3'，下游引物，5'-CCAGAGTCCAGCACAATACCAG-3'；SM22α上游引物，5'-CCCTCCATGGTCTTCAAGCA-3'，下游引物，5'-GCCCAAAGCCATTACAGTCCT-3'；OPN 上 游 引 物，5' - GATAGTGTTTTGGGCCCTGAG-3'，下 游 引 物，5'-TCCTGTAAGTTTGCCTGCCTC-3'。

1.2.5統(tǒng)計學方法 計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，應用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析進行均值比較。通過SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組主動脈壁中Foxp1 mRNA 和蛋白的表達情況RT-PCR 和Western Blot 的檢測結果顯示，夾層組主動脈壁中Foxp1 的mRNA 和蛋白較正常組表達明顯下調（均P＜0.05），同時檢測出TGFβ1、骨橋蛋白(OPN)的mRNA 和蛋白表達上調（均P＜0.05），以及α-SMA、SM22α 的mRNA 和蛋白表達下調（均P＜0.05）（圖1）。

圖1 RT-PCR 和Western Blot 檢測兩組主動脈壁中Foxp1、TGF-β1、α-SMA、SM22α 及OPN 的表達

2.2 Foxp1 質粒轉染結果VSMC 轉染Foxp1 的重組質粒24 h 后，將細胞放置在倒置顯微鏡下觀察，鏡下可見大量轉染成功的細胞（圖2）。

圖2 倒置顯微鏡觀察Foxp1 質粒轉染結果（×200）

2.3 RT-PCR 檢測各組細胞中Foxp1 以及VSMC表型標志物的mRNA 表達情況RT-PCR 檢測結果顯示，轉染Foxp1 質粒的VSMC 于完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，F(xiàn)oxp1 的mRNA 表達水平較空白對照組顯著上調（P＜0.05）；VSMC 放入添加5 ng/mL TGF-β1 的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后，收縮型細胞標志物α-SMA、SM22α 的mRNA 表達水平較空白對照組顯著下調，且合成型細胞標志物OPN 的mRNA 表達水平較空白組顯著上調（均P＜0.05）；VSMC 轉染Foxp1 的重組質粒，放入添加5 ng/mL TGF-β1 的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后，其收縮型細胞標志物α-SMA、SM22α 的mRNA 表達水平較單獨TGF-β1 處理組顯著上調，且合成型細胞標志物OPN 的mRNA 表達水平較單獨TGF-β1 處理組下調（均P＜0.05）（圖3）。

圖3 Foxp1、α-SMA、SM22α 和OPN 在各組細胞中mRNA 的表達水平

2.4 Western Blot 檢測各組細胞中Foxp1 以及VSMC 表型標志物的蛋白表達情況檢測結果顯示，轉染Foxp1 質粒的VSMC 于完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，F(xiàn)oxp1 的蛋白表達水平較空白對照組顯著上調（P＜0.05）；VSMC 放入添加5 ng/mL TGF-β1的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后，收縮型細胞標志物α-SMA、SM22α 的蛋白表達水平較空白對照組顯著下調，且合成型細胞標志物OPN 的蛋白表達水平較空白組顯著上調（均P＜0.05）；VSMC 轉染Foxp1的重組質粒，放入添加5 ng/mL TGF-β1 的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后，其收縮型細胞標志物α-SMA、SM22α 的蛋白表達水平較單獨TGF-β1 處理組顯著上調，且合成型細胞標志物OPN 的蛋白表達水平較單獨TGF-β1 處理組下調（均P＜0.05）（圖4）。

圖4 Foxp1、α-SMA、SM22α和OPN在各組細胞中蛋白的表達水平

3 討論

Foxp1 是Fox 家族的多結構域轉錄調控因子，基因位于染色體3p14.1 區(qū)域，長度628 kb，其特有的結構域包括一個發(fā)散的DNA 結合的有翼螺旋、亮氨酸拉鏈、鋅指和多聚谷氨酸束［5］。Foxp1 廣泛表達于血管、心肌和心內膜，并與心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展有著密切關系［6］。以往對于Foxp1 的研究主要集中于腫瘤和免疫等方向，但近年來Foxp1 對于心血管系統(tǒng)的調控成為了一個新的熱點，F(xiàn)oxp1已被證明參與了血管發(fā)育和生長的調控過程。研究表明，F(xiàn)oxp1 基因敲除可抑制斑馬魚血管平滑肌細胞的增殖并導致斑馬魚血管形成缺陷，提示了Foxp1 可能通過促進血管平滑肌細胞的增殖以調控血管生成［7］。另有研究顯示，TGF-β1 為Foxp1 在血管內皮細胞中的直接下游靶基因，EC-Foxp1 能通過TGF-β1/內皮素-1 信號通路調節(jié)病理性心肌纖維化和心肌肥大，表明Foxp1 可以通過TGF-β1 調控心肌細胞的生物學行為［3］。

主動脈壁由外膜、中膜和內膜三層結構組成，其中膜的主要成分為VSMC，其主要作用為保持血管壁的結構完整、維持血管張力以及調節(jié)血管直徑等［8］；VSMC 有收縮和合成型兩種表型，正常生理狀態(tài)下，VSMC 以低速率增殖，保持其細胞特性并表達高水平的收縮蛋白；病理狀態(tài)下，VSMC 失去其收縮特性并分化為合成表型，誘發(fā)主動脈瘤和夾層［9］。TGF-β1 是一種多效應細胞因子，調節(jié)多種生理過程，如細胞的增殖、分化、凋亡和遷移［10］。研究表明，TGF-β1 是VSMC 表型轉化的主要驅動因子［9，11］，應用TGF-β1 刺激人主動脈血管平滑肌細胞后可檢測出α-SMA、SM22α 表達下調以及OPN 的表達上調，這提示VSMC 發(fā)生了表型轉化。

本實驗中，進行了大鼠主動脈血管平滑肌細胞的原代培養(yǎng)，將細胞轉染Foxp1 的重組質粒，根據(jù)Zhu 等［12］實驗結果，選擇濃度為5 ng/mL 的TGF-β1加入完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞24 h，以促進細胞的表型轉化。將細胞做不同處理后分為3 組，并設立空白對照組；采用RT-PCR 和Western Bolt 方法檢測Foxp1 以及VSMC 表型轉化的相關標志分子（α-SMA、SM22α、OPN）。檢測結果顯示：+TGFβ1 組中的α-SMA、SM22α 的mRNA 和蛋白表達量較空白對照組減少，OPN 的mRNA 和蛋白表達量較空白對照組增加，再次驗證VSMC 在TGF-β1 刺激下可發(fā)生表型轉化。與+TGF-β1 組相比，F(xiàn)oxp1質粒轉染+TGF-β1 組α-SMA、SM22α 的mRNA 和蛋白表達量增加，OPN 的mRNA 和蛋白表達量減少；可見上調Foxp1 可以抑制TGF-β1 誘導VSMC表型轉化。同時對主動脈標本的檢測顯示：在夾層組主動脈壁中Foxp1 的表達量較正常組明顯下調，且TGF-β1 的表達量明顯上調，提示了Foxp1 可能通過抑制TGF-β1 誘導的VSMC 表型轉化，直接或間接參與了主動脈夾層的發(fā)生進展。

本實驗表明Foxp1 可以抑制TGF-β1 誘導的VSMC 表型轉化，可能參與主動脈中層退行性變導致主動脈夾層發(fā)生形成。針對Foxp1 對TGF-β1 的信號傳導，可能對臨床上主動脈夾層的治療提供新的思路，然而Foxp1 與TGF-β1 信號通路之間的機制尚不明確，需進一步研究探討。