王 童 鄧霓姍 李 昀 鐘潔瑩 倪海陽(yáng) 黃 毅 丁續(xù)紅 聶漢祥

武漢大學(xué)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 湖北 武漢 430060

支氣管哮喘是一種多種細(xì)胞參與的以高水平IgE 和Th2 反應(yīng)為病理生理特征的慢性氣道炎癥性疾病。樹(shù)突狀細(xì)胞是主要的專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞，可以誘導(dǎo)初始CD4+T 細(xì)胞分化為T(mén)h2 細(xì)胞，參與哮喘Th2 反應(yīng)的啟動(dòng)和維持［1］。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）在臨床上主要被用作為抗腫瘤化療藥物，但目前認(rèn)為小劑量5-FU（50 mg/kg）通過(guò)直接或間接影響機(jī)體的多種免疫細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［2］。研究發(fā)現(xiàn)小劑量5-FU 通過(guò)選擇性殺傷腫瘤相關(guān)髓源性抑制細(xì)胞從而增強(qiáng)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤免疫［3］，而炎性樹(shù)突狀細(xì)胞與髓源性抑制細(xì)胞可能來(lái)自于相同的前體細(xì)胞［4］，因此假設(shè)小劑量5-FU 可能在哮喘治療中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，從而影響哮喘氣道炎癥。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠哮喘模型，觀(guān)察小劑量5-FU 對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的影響，探討其在哮喘治療中的可能性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑6～8 周齡健康雌性野生型（Wild-type，WT）BALB/c 小鼠，無(wú)特定病原菌（Specific-Pathogen Free，SPF）環(huán)境飼養(yǎng)。雞卵清白蛋白（Ovalbumin，OVA，Grade Ⅴ）、氫氧化鋁凝膠和5-FU 購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；血清OVA 特異性IgE、IL-4、IL-5、IL-13 和IFN-γ ELISA 試劑盒購(gòu)于美國(guó)eBioscience 公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠分組和哮喘模型的建立 15 只WTBALB/c 小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分入正常對(duì)照組、哮喘對(duì)照組和5-FU 治療組，每組5 只。哮喘對(duì)照組和5-FU 治療組分別于第0 天、第14 天以O(shè)VA/Alum致敏液200 μL 腹腔注射進(jìn)行致敏，第21、22、23 天連續(xù)3 d 經(jīng)鼻腔滴入OVA 激發(fā)液50 μL 進(jìn)行激發(fā)；正常對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間以等量磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替。每次激發(fā)前，用1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射（劑量為60～80 mg/kg 體重）使小鼠麻醉。其中5-FU 治療組在第一次激發(fā)前24 h 給予單次5-FU（50 mg/kg）腹腔注射，正常和哮喘對(duì)照組則在相應(yīng)時(shí)間使用等量PBS 替代。

1.2.2標(biāo)本的收集處理與細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)檢查各組小鼠于末次激發(fā)24 h 后進(jìn)行眼球取血收集標(biāo)本，并予以肝素抗凝，3 000 r/min 離心10 min 分離出血清，-80 ℃保存，用于檢測(cè)OVA 特異性IgE 水平。取血后暴露小鼠頸部氣管，插入套管針，暴露胸腔，結(jié)扎右肺門(mén)，用含1 mmol/L EDTA 的冷PBS 0.5 mL 灌洗，每次在肺內(nèi)停留30 s，回抽肺泡灌洗液，共3 次，灌洗時(shí)注意觀(guān)察小鼠兩側(cè)胸廓起伏程度是否一致，有無(wú)漏液，回抽率在80%以上被認(rèn)為灌洗成功。支氣管肺泡灌洗液（BALF）在4 ℃下1 500 r/min 離心7 min，-80 ℃保存上清液，用于檢測(cè)IL-4、IL-5、IL-13 和IFN-γ的水平。使用含1%BSA 的PBS 重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×109/L，取100 μL 細(xì)胞懸液離心涂片，瑞氏-姬姆薩染色檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)。取小鼠左肺組織，以10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋后切片，采用蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）和糖原染色（periodic acid-schiff staining，PAS）觀(guān)察肺組織炎癥細(xì)胞和氣道基底膜PAS 陽(yáng)性細(xì)胞（杯狀細(xì)胞）。

1.2.3ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞因子 采用ELISA 法檢測(cè)血清OVA 特異性IgE 及BALF 中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的水平，具體步驟參考試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠HE 及PAS 染色的比較采用HE和PAS 染色評(píng)估小鼠氣道炎癥浸潤(rùn)和杯狀細(xì)胞增生程度。HE 染色可見(jiàn)正常對(duì)照組小鼠肺組織支氣管及血管周?chē)鸁o(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管黏膜上皮完整，肺間質(zhì)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔完整。哮喘對(duì)照組小鼠肺組織或血管周?chē)梢?jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，聚集成團(tuán)明顯，細(xì)胞層數(shù)超過(guò)5 層，支氣管黏膜上皮脫落明顯，肺間質(zhì)也可見(jiàn)成團(tuán)細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔斷裂，多個(gè)肺泡融合。5-FU 治療組小鼠肺組織支氣管或血管周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，支氣管黏膜少有脫落，肺泡間隔較為完整（圖1）。

圖1 各組小鼠肺組織HE 染色和PAS 染色

PAS 染色中正常對(duì)照組小鼠氣道無(wú)PAS 陽(yáng)性細(xì)胞，而哮喘對(duì)照組小鼠氣道可見(jiàn)大量PAS 陽(yáng)性細(xì)胞（圖1）。5-FU 治療組、哮喘對(duì)照組和正常對(duì)照組小鼠氣道單位長(zhǎng)度基底膜PAS 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量分別為（66±6）、（97±5）和（0±0）個(gè)/mm，3 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（見(jiàn)圖2）。

圖2 各組小鼠氣道單位長(zhǎng)度基底膜（mm）PAS 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量（**P＜0.01）

2.2 各組小鼠BALF 中細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)染色的比較正常對(duì)照組小鼠BALF 中細(xì)胞主要為巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞較少，未檢測(cè)到有中性粒細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞。哮喘對(duì)照組小鼠BALF 中細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；5-FU 治療組小鼠BALF 中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞數(shù)和巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于哮喘對(duì)照組（P＜0.01）（圖3）。

圖3 各組小鼠BALF 中細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)

2.3 各組小鼠血清OVA 特異性IgE 及BALF 中IL-4、IL-5、IL-13 和IFN-γ 水平的比較正常對(duì)照組小鼠血清OVA 特異性IgE 及BALF 中IL-4、IL-5、IL-13 均處于較低水平。哮喘對(duì)照組和5-FU 治療組小鼠血清OVA 特異性IgE 的濃度值分別為（95.2±5.0）ng/mL 和（71.4±3.6）ng/mL，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖4）。5-FU 治療組小鼠BALF 中IL-4、IL-5、IL-13 水平均明顯低于哮喘對(duì)照組（P＜0.01）（圖5）。5-FU 治療組和哮喘對(duì)照組小鼠的BALF 中IFN-γ水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但均低于正常對(duì)照組（P＜0.01）（圖5）。

圖4 各組小鼠血清OVA 特異性IgE 水平

圖5 各組小鼠BALF 中IL-4、IL-5、IL-13 和IFN-γ 水平

3 討論

支氣管哮喘是一種由多種細(xì)胞，如肥大細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等參與的慢性氣道炎癥性疾病。目前，哮喘治療的基本方案是吸入糖皮質(zhì)激素聯(lián)用或不聯(lián)用β2 受體激動(dòng)劑。這種方案可以使大部分哮喘患者獲得良好控制。然而，即使是吸入高劑量糖皮質(zhì)激素和長(zhǎng)效β2受體激動(dòng)劑或聯(lián)用茶堿/白三烯調(diào)節(jié)劑，甚至是系統(tǒng)性使用糖皮質(zhì)激素，仍然存在3.7%的重癥哮喘和17%的難治性哮喘患者［5］。對(duì)于這部分哮喘患者，治療選擇有限。因此，尋找哮喘治療的新方法尤顯必要。

5-FU 是一種臨床上廣泛應(yīng)用的嘧啶類(lèi)抗腫瘤化療藥，主要用于消化道腫瘤、乳腺癌和宮頸癌等惡性腫瘤的治療。5-FU 的抗腫瘤效應(yīng)主要是通過(guò)抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）的活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA 合成原料缺乏，干擾腫瘤細(xì)胞增殖［6］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)小劑量5-FU 具有免疫調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)小劑量5-FU 可以減輕急性胰腺炎相關(guān)免疫細(xì)胞因子的異常反應(yīng)，調(diào)節(jié)炎癥失調(diào)，緩解急性胰腺炎的病理生理紊亂，結(jié)果提示小劑量5-FU 通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)發(fā)揮抗炎效應(yīng)［7］。本研究發(fā)現(xiàn)小劑量5-FU 可以抑制哮喘小鼠血清OVA 特異性IgE 水平，降低BALF 中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞數(shù)和巨噬細(xì)胞數(shù)，減輕肺組織支氣管炎癥細(xì)胞和杯狀細(xì)胞浸潤(rùn)，提示小劑量5-FU 可以抑制哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)小劑量5-FU 治 療 可 以 使 哮 喘 小 鼠BALF 中IL-4、IL-5 和IL-13 的水平明顯降低。目前認(rèn)為CD4+Th2 細(xì)胞是哮喘發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，它通過(guò)產(chǎn)生Th2 細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5 和IL-13 等參與形成哮喘的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性［8］。IL-4 可以刺激B 細(xì)胞產(chǎn)生IgE，促進(jìn)Th0 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞方向分化，抑制Th0 細(xì)胞向Th1 細(xì)胞分化；IL-5 促進(jìn)嗜酸粒細(xì)胞分化，延長(zhǎng)氣道中嗜酸粒細(xì)胞的存活［9］，IL-13 則誘導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞增多、黏液產(chǎn)生、氣道重塑和氣道高反應(yīng)性［10］。因此，我們推測(cè)小劑量5-FU 可能通過(guò)抑制Th2 細(xì)胞因子水平進(jìn)一步控制哮喘氣道炎癥。目前認(rèn)為樹(shù)突狀細(xì)胞作為主要的抗原提呈細(xì)胞可以誘導(dǎo)初始CD4+T 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞分化，啟動(dòng)和維持哮喘Th2 免疫反應(yīng)。研究顯示小鼠肺樹(shù)突狀細(xì)胞可以分為髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞（myeloid dendritic cells，mDCs）和漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）。mDCs 又稱(chēng)為經(jīng)典樹(shù)突狀細(xì)胞（conventional dendritic cells，cDCs），其可以分為1 型經(jīng)典 樹(shù) 突 狀 細(xì) 胞（conventional DCs 1，cDCs1），即CD103+經(jīng)典樹(shù)突狀細(xì)胞（CD103+cDCs）和2 型經(jīng)典 樹(shù) 突 狀 細(xì) 胞（conventional DCs 2，cDCs2），即CD11b+經(jīng)典樹(shù)突狀細(xì)胞（CD11b+cDCs）［11］。在感染或吸入過(guò)敏原時(shí)，肺的屏障上皮細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生促炎趨化因子如CCL2 和CCL7，可以促進(jìn)骨髓釋放CCR2hi單核細(xì)胞，當(dāng)這些單核細(xì)胞作為炎癥反應(yīng)的一部分到達(dá)氣道黏膜時(shí)，進(jìn)一步分化為單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞（monocyte-derived dendritic cells，moDCs），又 稱(chēng) 為 炎 性 樹(shù) 突 狀 細(xì) 胞［12］。目 前 認(rèn) 為CD11b+cDCs 和moDCs 均可有效誘導(dǎo)Th2 細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致哮喘氣道炎癥［13］，CD103+經(jīng)典樹(shù)突狀細(xì)胞在哮喘Th2 反應(yīng)中的作用有限，甚至主要是誘導(dǎo)免疫耐受，而漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞主要與誘導(dǎo)氣道免疫耐受有關(guān)［14］。Poncini 等［15］研究發(fā)現(xiàn)在急性皮膚克氏錐蟲(chóng)感染小鼠模型中腹腔注射小劑量5-FU 可以選擇性誘導(dǎo)小鼠脾臟炎性樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而對(duì)正常小鼠脾臟B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞無(wú)影響。因此，我們推測(cè)小劑量5-FU 可能通過(guò)作用于肺炎性樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)而抑制哮喘小鼠Th2 反應(yīng)，進(jìn)一步控制哮喘小鼠氣道炎癥。臨床上，5-FU 用作為化療藥物治療腫瘤時(shí)的主要副作用有食欲不振，惡心嘔吐；骨髓抑制，表現(xiàn)為白細(xì)胞減少、血小板減少和貧血；肝功能損害等［16］。然而，5-FU 發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用所需的劑量為小劑量，定義為對(duì)小鼠沒(méi)有毒性作用且發(fā)揮最大效應(yīng)，這個(gè)最佳劑量為50 mg/kg［17］。目前臨床使用中發(fā)現(xiàn)連續(xù)低劑量5-FU 相比高劑量的5-FU，在治療效果沒(méi)有顯著差異的情況下其血液學(xué)毒性明顯降低，白細(xì)胞減少癥發(fā)生率顯著下降［18］，但在哮喘治療中的副作用需進(jìn)一步研究。

綜上所述，小劑量5-FU 可以減輕哮喘小鼠的氣道炎癥，可能是通過(guò)抑制Th2 反應(yīng)發(fā)揮作用，這可能為哮喘的治療提供新的思路。