蔡 濤 宋小兵

1江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院胃腸外科 湖北 武漢 430030；2武漢大學(xué)中南醫(yī)院急救中心 湖北 武漢 430071

肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有惡性程度高、較早發(fā)生侵襲和血性轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點(diǎn)。我國(guó)為肝癌的高發(fā)區(qū)，肝癌嚴(yán)重威脅著我國(guó)人民的生命和健康，是我國(guó)惡性腫瘤的第二位死因，5 年存活率僅20%～30%［1，2］。近年來(lái)研究表明，非編碼小分子同微小RNA（miRNAs；miR）在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用，作為生物標(biāo)志物在惡性腫瘤的診斷或預(yù)后中具有重要意義。miRNAs 是一種長(zhǎng)為18～25 bp 的真核生物內(nèi)源性小分子單鏈RNA，通過(guò)miRNA 與靶mRNA 的3'端非翻譯區(qū)結(jié)合，從而影響mRNA 的穩(wěn)定性或抑制蛋白的翻譯而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用［3］。miRNA 調(diào) 控 約1/3 的蛋白編碼基因，并且參與了包括細(xì)胞增殖、分化等在內(nèi)的諸多生理生化過(guò)程。近年來(lái)有關(guān)已有大量研究表明多種miRNA 與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后存在密切關(guān)系。

在真核生物體內(nèi)，miR-17-92 基因簇作為miRNA 的重要成員，由6 個(gè)成熟的miRNA 組成，包括miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a 和miR-92a，已被證實(shí)在肝癌［4，5］、肺癌［6］、前列腺癌［7］、乳腺癌［8］、胃癌［9］、結(jié)直腸癌［10］等多種惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)，且與腫瘤的分期、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。因此，本文主要研究miR-19a 在肝癌中的表達(dá)情況，探討其在肝癌患者診斷及預(yù)后中的臨床價(jià)值。miR-19a作為一種新型腫瘤標(biāo)志物具有非常重要意義，也為藥物的靶向研究提供理論依據(jù)和新的治療前景。

1 材料與方法

1.1 患者資料及樣本收集選取武漢大學(xué)中南醫(yī)院自2016—2018 年普外科收治的肝癌患者病理切片中100 例凍存肝癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，本研究經(jīng)患者同意并簽署知情同意書(shū)。其中男性55例，女性45 例，年齡10～75 歲，年齡＜60 歲患者48例，年齡≥60 歲患者52 例。隨訪1～36 個(gè)月，其中隨訪期間總死亡31 例。Enneking 外科診斷分期：Ⅰ期及Ⅱa 期病例63 例，Ⅱb 期及Ⅲ期37 例（P＜0.05）。

1.2 PCR 實(shí)驗(yàn)方法按照說(shuō)明，將組織使用TRIzol 及 氯 仿 提 取RNA。取1 μg 總RNA 反 轉(zhuǎn) 錄成cDNA，以cDNA 為模板，用Real-Time PCR 內(nèi)參基因GAPDH 引物做q-PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)基因miR-19a 的表達(dá)水平。Real-Time PCR 反應(yīng)體系：SYBR?Premix ExTaqTMⅡ（2×）25 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）2 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）2 μL，ROX Reference Dye（50×）1 μL，DNA 模板4 μL，ddH2O（滅菌蒸餾水）16 μL；反應(yīng)條件：95 ℃、30 s 一個(gè)循環(huán)，然后95 ℃、5 s，60 ℃、30 s進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。每一個(gè)基因的表達(dá)水平以其相對(duì)內(nèi)參GAPDH 的水平的形式呈現(xiàn)，使用的PCR 引物見(jiàn)表1。用GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行定量和分析，最后結(jié)果以2-△△Ct分析。

表1 目的基因PCR 實(shí)驗(yàn)引物序列

1.3 Western Blot 實(shí)驗(yàn)方法收集細(xì)胞后加入1 mL RIPA 裂解液，用玻璃勻漿器在冰上勻漿；10 000 r/min 離心5 min，取上清，加入等體積2×loading buffer，沸水煮5 min，冷卻后進(jìn)行SDSPAGE 電泳，采用200 V 的電壓，電泳直至溴酚藍(lán)上樣緩沖液在凝膠中遷移至凝膠底部時(shí)停止，并轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗4 ℃過(guò)夜，二抗室溫1 h，最后在暗室中膠片曝光。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)PTEN 3'UTR 與miR-19a 的結(jié)合序列通過(guò)TargetScanHuman version 7.1（www. targetscan. org/vert_71/）預(yù)測(cè)其潛在結(jié)合位點(diǎn)。將具有螢光素酶活性和腎素酶活性的pGL3-熒光素酶載體（武漢金凱瑞生物工程有限公司，武漢）用XbaⅠ酶剪切，插入目的基因序列。將含有結(jié)合位點(diǎn)的PTEN 3'UTR 啟動(dòng)子序列合成為野生型（WT）質(zhì)粒（PTEN-WT）；同樣，PTEN 的突變結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建為突變型（MT）質(zhì)粒（PTENMT）。使用Lipofectamine 2000（5 μL）進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h。然后收集并裂解各組共轉(zhuǎn)染細(xì)胞使用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)系統(tǒng)（Promega，美國(guó)），測(cè)量細(xì)胞裂解物中的熒光素酶活性。

1.5 數(shù)據(jù)分析計(jì)量資料采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料行卡方檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行分析。當(dāng)P＜0.05 時(shí)，則差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-19a 與肝癌患者臨床病理因素的關(guān)系

收集統(tǒng)計(jì)患者的臨床數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析表明，miR-19a的表達(dá)與患者性別、年齡沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，兩組患者具有可比性?；颊適iR-19a 的表達(dá)與血甲胎蛋白（AFP）值無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。miR-19a的表達(dá)與肝癌患者腫瘤大小及TNM 分期有關(guān)，低表達(dá)的miR-19a 與較小的腫瘤體積（P=0.001，表2）和較低的TNM 分級(jí)有關(guān)（P=0.001，表2）。

表2 肝癌組織miR-19a 水平與患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性

2.2 miR-19a 在肝組織及癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)及預(yù)后的影響100 例肝癌腫瘤患者手術(shù)切除的標(biāo)本中，腫瘤組織中miR-19a 表達(dá)水平明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織（P＜0.001，圖1A 和1B）。將腫瘤患者分為miR-19a 高表達(dá)組（n=49）和低表達(dá)組（n=51）。所有患者均獲得隨訪，末次隨訪時(shí)間為2018年12 月。隨訪時(shí)間1～36 個(gè)月，因復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移死亡患者總共有31 例。隨訪結(jié)果表明，miR-19a 低表達(dá)組患者3 年無(wú)腫瘤復(fù)發(fā)率明顯高于miR-19a 高表達(dá)組（P＜0.05，圖1C）。miR-19a 低表達(dá)組患者3 年生存率明顯高于miR-19a 高表達(dá)組（P＜0.05，圖1D）。

圖1 q-PCR 檢測(cè)miR-19a 在肝癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后的影響

2.3 miR-19a 對(duì)PTEN 及其下游基因相關(guān)通路蛋白的影響轉(zhuǎn)染miR-19a inhibitor 后抑制miR-19a的表達(dá)。RT-PCR 結(jié)果表明，下調(diào)的miR-19a 可促進(jìn)PTEN mRNA 的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2A）。同時(shí)Western Blot 結(jié)果表明，下調(diào)的miR-19a 可促進(jìn)PTEN 蛋白的表達(dá)，并影響下游Akt 蛋白的表達(dá)（圖2B）。

圖2 抑制miR-19a 可促進(jìn)PTEN 的表達(dá)

2.4 miR-19a 靶向調(diào)節(jié)PTENmiR-19a inhibitor和WT-PTEN-3'UTR 共轉(zhuǎn)染可抑制螢光素酶活性（P＜0.05），而用Mut-PTEN-3'UTR 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在有或沒(méi)有miR-19a inhibitor 的情況下，UTR 均未表現(xiàn)出熒光素酶活性的改變（圖3）。

圖3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-19a靶向作用于PTEN 結(jié)合位點(diǎn)

3 討論

肝癌是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，肝癌的早期診斷和治療越來(lái)越迫切。尋找高靈敏度、高特異度的生物標(biāo)志物在肝癌的篩查和早期診斷中越來(lái)越重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和前景。 研究表明microRNAs 在肝癌的篩查、診斷和預(yù)后判斷中具有重要意義。其中miR-17-92 與人類癌癥的發(fā)病密切相關(guān)，在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，包括結(jié)腸癌、B細(xì) 胞 淋 巴 瘤、胃 癌 和 小 細(xì) 胞 肺 癌［11］。miR-19a 是miR-17-92 家族中重要的成 員［12］。miR-17-92 基因簇定位于13q31.3（即13 號(hào)染色體25 號(hào)開(kāi)放閱讀框的3 號(hào)內(nèi)含子區(qū)域）。該基因編碼產(chǎn)生6 個(gè)成熟的miRNAs：miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b 和miR-92a［13］。

miR-19a 作為miR-17-92 基因簇基因的重要成員，促進(jìn)其表達(dá)可提高PTEN 的活性及有效含量，提高PTEN 基因啟動(dòng)子的表達(dá)水平，形成一個(gè)開(kāi)放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)與轉(zhuǎn)錄因子Egr-1 的結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)基因的表達(dá)［14，15］；同時(shí)增強(qiáng)PTEN 蛋白與目標(biāo)蛋白PDZ 結(jié)合序列的相互作用，從而加強(qiáng)PTEN 的作用效應(yīng)，抑制PTEN/PI3K/Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，阻滯腫瘤生長(zhǎng)［16-18］。

由于肝癌具有較早發(fā)生轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-19a 在癌組織的表達(dá)明顯高于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織；且高表達(dá)與腫瘤的病理分期密切相關(guān)［19，20］；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率也明顯高于低表達(dá)組。下調(diào)miR-19a 可靶向調(diào)節(jié)PTEN/Akt 通路從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞的作用。因此，miR-19a 通過(guò)參與細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)而影響腫瘤增殖的生物學(xué)特性，具有作為肝癌生物標(biāo)志物的潛力。預(yù)后分析表明miR-19a 的表達(dá)情況與肝癌患者預(yù)后密切相關(guān)，因此，作為肝癌預(yù)后生物標(biāo)志物，miR-19a 具有重要的應(yīng)用前景和臨床應(yīng)用價(jià)值。