李國梁,李 浩,王 瑋,陳克正

(青島科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島266042)

光熱治療(PTT)是在近紅外激光照射下,通過光熱治療劑將光能轉(zhuǎn)化為熱能,達到一定溫度后(一般為48 ℃以上)殺死腫瘤細胞,從而達到治療腫瘤的目的。光熱治療劑是能夠?qū)⒐饽苻D(zhuǎn)化為熱能的物質(zhì),使腫瘤區(qū)域急劇升溫,達到熱消融的目的[1-2]。理想的光熱治療劑應(yīng)該具備在近紅外區(qū)有強烈吸收、良好的生物相容性、較高的光熱轉(zhuǎn)化效率等特點[3-4]。目前,研究者們已開發(fā)出多種光熱治療劑,如貴金屬類的金納米顆粒[5-7]、碳基材料類的碳納米管[8-9]、半導(dǎo)體類的硫?qū)巽~基納米顆粒[10-12]、有機光熱材料[13]等。

另外,研究較多的有機光熱治療劑主要有聚吡咯等共軛高分子聚合物[13]、近紅外染料類材料[14]、卟啉脂質(zhì)體[15]等。然而,大部分的有機光熱材料水溶性較差,需要通過聚乙二醇(PEG)等親水性生物分子的修飾以此增強其在水環(huán)境中的分散性,這一過程可能會引入外在的潛在毒性[16-17]。基于以上考慮,本工作通過一種仿酶綠色合成工藝合成了水溶性聚苯胺(PANI)并探究其在腫瘤的光熱治療方面的應(yīng)用。

1 實驗部分

1.1 實驗材料及儀器

雙氧水,分析純(30%),萊陽經(jīng)濟開發(fā)區(qū)精細化工廠;聚苯乙烯磺酸鈉,分析純,上海喜潤化學(xué)工業(yè)有限公司;苯胺單體,分析純(98%),阿法埃莎(中國)化學(xué)有限公司;聚乙烯吡咯烷酮,分析純,上海埃彼化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇,分析純(＞99.0%)萊陽經(jīng)濟開發(fā)區(qū)精細化工廠;氯化亞鐵,分析純,天津市博迪化工有限公司;乙二醇,分析純,天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;次亞磷酸鈉,分析純,上海埃比化學(xué)試劑有限公司;二甲亞砜(DMSO),分析純,北京索萊寶科技有限公司;3-(4,5)-雙甲基-2-噻唑-(2,5)-二苯基溴化四氮唑藍,生化試劑,北京索萊寶科技有限公司;DMEM 培養(yǎng)基,生化試劑,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;胎牛血清,生化試劑,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;L-谷氨酰胺,生化試劑,北京索萊寶科技有限公司;青鏈霉素,生化試劑,北京索萊寶科技有限公司。

高壓釜,50 m L 上海安譜科學(xué)儀器有限公司;動物血細胞分析儀,XFA6030型,中國普朗醫(yī)療有限公司;活細胞工作站,DMI6000B 型,德國Leica公司;傅里葉紅外光譜儀(FTIR),VERTEX70 型,德國Bruker公司;紫外-可見-近紅外分光光度計,Cary500型,美國Varian公司;紅外功率可調(diào)激光發(fā)射器,T808D3W 型,西安銘輝廣電科技有限公司;酶標儀,Model 680型,美國Bio Rad公司;熒光顯微鏡,Eclipse TE2000S型,日本Nikon公司。

實驗涉及的細胞系:人肝癌細胞系Hep G2(實驗室自有),小鼠胚胎成纖維細胞系NIH3T3(實驗室自有)。

實驗動物:Balb/c裸鼠(雌性,4～6周齡,20 g,北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,北京)。相關(guān)動物實驗操作程序均是在有動物實驗資質(zhì)的實驗室完成的,獲得相關(guān)實驗動物倫理委員會的批準。

1.2 磷酸鐵模擬酶的制備

分別用電子天平準確稱取5 g H2O、50 g乙二醇、1 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),將去離子水和乙二醇緩慢滴加到盛有PVP的潔凈燒杯中,同時使用磁力攪拌器攪拌溶解;再準確稱取1.689 g FeCl2·H2O和1.317 g的Na H2PO2·H2O 倒入上述攪拌好的溶液中,繼續(xù)攪拌至溶解;然后將溶液轉(zhuǎn)移到高壓反應(yīng)釜的聚四氟乙烯內(nèi)襯中密封,置于恒溫烘箱中在180 ℃下反應(yīng)6 h;取出反應(yīng)釜冷卻;打開反應(yīng)釜對產(chǎn)物進行離心收集并通過去離子水和乙醇洗滌,離心;然后將產(chǎn)物用乙醇分散,置于鼓風(fēng)干燥箱中60℃干燥,即可得到磷酸鐵模擬酶。

1.3 PANI的制備

準確稱取0.124g聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)溶解于20 m L緩沖液,于冰水浴中攪拌30 min后,加入0.056 g苯胺單體,攪拌10 h后加入5 mg自制的磷酸鐵模擬酶,再用移液槍準確移取0.6 m L 物質(zhì)的量濃度為1 mol·L－1的雙氧水溶液,在室溫下反應(yīng)24 h后,將反應(yīng)液離心以去除磷酸鐵模擬酶,上清液轉(zhuǎn)移入截留相對分子質(zhì)量為8 000～14 000的透析袋中,在p H＝5的鹽酸溶液中透析24 h,更換透析液后再次透析24 h,將透析袋內(nèi)的溶液于40℃下真空干燥,獲得產(chǎn)物PANI。

1.4 MTT法體外細胞相容性評價

MTT 法是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理是活細胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶可以將外源性的噻唑藍(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-Diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)還原為水不溶性的藍紫色甲臜并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚,用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm 波長處測定其光吸收值(OD 值),可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi),MTT 結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。

將材料與細胞共培養(yǎng)24 h,隨后將培養(yǎng)板取出倒掉培養(yǎng)液,在培養(yǎng)板的所有孔上加入20μL 的5 mg·m L－1的噻唑藍溶液;培養(yǎng)4 h后,倒掉噻唑藍溶液,用酶標儀測定各孔在490 nm 處的OD 值;向每個孔中加入150μL DMSO,使用恒溫振蕩器低速振蕩10 min,待結(jié)晶物質(zhì)充分溶解后再測定各孔在490 nm 處的OD 值。以兩次吸光度的差值作為細胞相對存活量,通過加入材料和未加材料的培養(yǎng)孔的吸光度之比確定各組的相對細胞存活率。

1.5 光熱療法體外效果評價

用細胞培養(yǎng)液(DMEM 培養(yǎng)基中含10%胎牛血清)在培養(yǎng)面積25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)Hep G2細胞。待細胞密度達到80%～90%時,將Hep G2細胞轉(zhuǎn)移到96孔培養(yǎng)板上繼續(xù)培養(yǎng);將96孔培養(yǎng)板上分為相同的4 個區(qū)域,設(shè)置為control組,PANI-only組,PTT-only組,PANI-PTT 組。將滅菌后的PANI用新鮮的細胞培養(yǎng)液稀釋為100 μg·m L－1,用含有PANI的培養(yǎng)液在37℃,5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中與HepG2細胞共培養(yǎng)6 h;去除多余PANI,用磷酸鹽緩沖液(PBS)潤洗3次。其中PTT-only組和PANI-PTT 組細胞經(jīng)808 nm 激光(2 W·cm－2)照射5 min;光照結(jié)束后,立即給4組加入MTT,進行細胞存活率測定。

VR自誕生以來，總被認為是一款實用性不高的“花瓶”。市面上較多較便宜的VR眼鏡是需要借助手機的，將智能手機放入VR眼鏡中，在手機中下載相應(yīng)的APP(application)便可使用。由于手機被置入眼鏡中使用者將無法操作手機，所以必須配備一個藍牙手柄進行操作。市面上還有較貴的VR一體機使用較為方便。但目前的VR設(shè)備大都仍處于開發(fā)者版本，并不夠成熟。

1.6 體內(nèi)光熱抑瘤實驗

四周齡Balb/c雌性裸鼠,放入三級無特定病原體動物(SPF)房飼養(yǎng)。DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝癌細胞HepG2,細胞生長至對數(shù)生長期時,胰酶常規(guī)消化,離心收集細胞并對細胞進行計數(shù)。采用生理鹽水溶解細胞團,并稀釋細胞濃度至1×108個·m L－1。取200μL即2×107個細胞接種于每只裸鼠的前肢腋下,觀察細胞接種后的生長狀況。

待腫瘤大小接近200 mm3時,將裸鼠分為PBS對照組、PANI-only組、Laser-only組和PANI-PTT組,每組10只模型動物。隔天原位給藥200μL(2 mg·m L－1),給藥3次,隔日測量體重、腫瘤體積和死亡情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 PANI的成分分析

由圖1可知:3 432 cm－1處的峰,是由－NH2非對稱伸縮振動引起的;1 600 cm－1處的峰,是NQN伸縮振動引起的;1 496 cm－1處的峰,是苯環(huán)伸縮振動引起的;1 411 cm－1處的峰,是QBQ 結(jié)構(gòu)中的C—N 伸縮振動引起的;1 006.29 cm－1和1 034 cm－1處的峰,分別是SO 對稱振動和非對稱振動引起的;831 cm－1處的峰,是1,4取代C—H面外彎曲振動引起的,同時說明產(chǎn)物中單體的連接方式為頭-尾相連;670 cm－1處的峰,是由PSS 上的—SO3引起的。綜上所述,實驗中所用的磷酸鐵模擬酶確實具有催化活性,催化合成的產(chǎn)物為聚苯胺和聚苯乙烯磺酸鈉的復(fù)合物。

圖1 所合成聚苯胺的FT-IR圖譜和水溶液照片F(xiàn)ig.1 FT-IR spectrum of PANI and photo of PANI in water solution

在不添加穩(wěn)定劑和表面修飾劑的前提下,當(dāng)PANI在水溶液中的濃度高達150 mg·m L－1時,仍然能夠在靜置1周后保持澄清且無沉淀產(chǎn)生,由此說明其具有優(yōu)異的水分散性和穩(wěn)定性。

2.2 PANI的體外光熱轉(zhuǎn)換效率測試

為探討PANI的光熱轉(zhuǎn)化能力,使用波長為808 nm 近紅外激光對2 m L 不同濃度PANI溶液進行光熱轉(zhuǎn)換升溫測試,結(jié)果見圖2。如圖2(a)所示,當(dāng)激光功率為1.0 W 時,去離子水的溫度僅升高0.3 ℃,而100～400μg·m L－1的PANI水溶液的溫升在3.1～7.4 ℃范圍內(nèi);當(dāng)激光功率為1.5 W 時,去離子水的溫度僅升高1.0 ℃,而100～400μg·m L－1的PANI水溶液的溫升在8.2～18.3 ℃范圍內(nèi);當(dāng)激光功率為2.0 W 時,去離子水的溫度僅升高1.0 ℃,而100～400μg·m L－1的PANI水溶液的溫升在12.2～27.9 ℃范圍內(nèi)。測試結(jié)果表明,PANI水溶液在808 nm 激光照射下的升溫幅度明顯大于去離子水的升溫幅度。當(dāng)PANI水溶液濃度達到300μg·m L－1時,再升高PANI的濃度(400μg·m L－1),PANI升溫已經(jīng)不隨濃度發(fā)生太大變化,說明PANI的升溫已經(jīng)達到飽和。

比較光熱轉(zhuǎn)換材料的光熱轉(zhuǎn)換能力,需要通過光熱轉(zhuǎn)換效率來比較,本研究利用公式式(1)～(5)對PANI的光熱轉(zhuǎn)換效率進行了測試和計算。其中,η為聚吡咯的光熱轉(zhuǎn)換效率,Tmax為聚吡咯溶液或水的最大溫度,Tsurr為環(huán)境溫度,A808為聚吡咯溶液在808 nm 處的吸光度,Qdis為環(huán)境所散發(fā)的熱量,C為水的比熱容,T為聚吡咯溶液或水在測溫時的實時溫度,m為溶液質(zhì)量,t為時間,I為激光功率。

2 m L PANI水溶液在808 nm 激光照射下的升溫降溫曲線見圖2(b),UV-Vis-NIR 的吸收光見圖2(c)?？梢运愠鯬ANI 的光熱轉(zhuǎn)換效率達到39.6%,具有良好的光熱轉(zhuǎn)換效率。

2.3 PANI的生物相容性評價

PANI的生物相容性評價結(jié)果如圖3所示,PANI濃度在低于1μg·m L－1時,細胞存活率高于90%,在低于10μg·m L－1時,細胞相對存活率高于80%,當(dāng)PANI質(zhì)量濃度為100μg·m L－1時,兩種細胞的相對存活率高于75%。從腫瘤細胞和正常細胞的比較來看,PANI對兩種細胞的生長抑制沒有顯著性差異。

圖3 聚苯胺對不同細胞的細胞毒性Fig.3 Cell viability of different kinds of cells after being incubated with various concentrations of PANI

2.4 定量評價PANI的光熱細胞毒性

采用MTT 法評價PANI的光熱細胞毒性,結(jié)果如圖4所示。

圖4 PANI的光熱細胞毒性Fig.4 Photothermal cytotoxicity of PANI

與PANI共培養(yǎng)的細胞經(jīng)照射后細胞存活率為40%,而未添加材料的細胞存活率近80%。盡管實驗使用的PANI濃度只有100μg·m L－1,在激光照射(808 nm,2 W·cm－2)5 min后,能夠非常有效地抑制腫瘤細胞的增殖。

2.5 PANI裸鼠腫瘤模型體內(nèi)抑瘤效果評價

圖5 為光熱治療后Balb/c裸鼠的體重監(jiān)測。從圖5可以發(fā)現(xiàn),經(jīng)過3周的治療,各組模型小鼠的體重變化波動不明顯,沒有顯著性的差異,說明相關(guān)實驗沒有對小鼠產(chǎn)生明顯的刺激,其進食和代謝正常進行。

圖5 光熱治療后Balb/c裸鼠的體重監(jiān)測Fig.5 Body weight change of Balb/c mice after PTT

經(jīng)常3周多的治療,抑瘤曲線變化明顯,如圖6所示。PBS對照組的腫瘤呈現(xiàn)指數(shù)增長,3周后腫瘤相當(dāng)于接種時腫瘤的36倍;PANI-only組和Laser-only組的腫瘤生長也非常迅速,最終的腫瘤大小接近初始腫瘤的32倍,并未抑制住腫瘤的生長。PANI-PTT 組的腫瘤生長較為緩慢,2周時腫瘤體積約為初始體積的4倍,而3周時的腫瘤體積約為初始體積的3.8倍。實驗可以發(fā)現(xiàn)PANI介導(dǎo)的光熱治療能有效抑制腫瘤生長,體現(xiàn)出良好的光熱治療性能。

圖6 腫瘤體積的生長曲線Fig.6 Curves of tumor volume growth

在進行一次完整的激光照射實驗后,繼續(xù)對模型小鼠的存活情況進行2周的記錄,結(jié)果如圖7所示。PBS對照組在第4 周時模型小鼠開始陸續(xù)死亡,在第35 d時全部死亡;PANI-only組和Laseronly組的模型小鼠也死亡較快,在第35 d的存活率分別為33%和15%,而PANI-PTT 組在第5周時存活率仍高達83%。以上體內(nèi)治療結(jié)果證明PANI能作為一種新型的光熱治療劑用于腫瘤的治療。

圖7 Balb/c裸鼠生存率隨時間變化曲線Fig.7 Survival curves of Balb/c nude mice

3 結(jié) 論

1)所合成的聚苯胺(PANI)具有良好的水溶性,當(dāng)其在水溶液中的濃度高達150 mg·m L－1時,在靜置1周后仍然保持澄清且無沉淀產(chǎn)生。

2)實驗合成的PANI在近紅外區(qū)域有較強吸收,能將光能高效的轉(zhuǎn)化為熱能,具有優(yōu)秀的光熱轉(zhuǎn)換性能。實驗結(jié)果顯示,PANI的光熱轉(zhuǎn)換效率高達39.6%。

3)MTT 實驗結(jié)果顯示:PANI具有較低的生物毒性,證明PANI具有優(yōu)秀的生物相容性。MTT實驗和模型小鼠活體實驗等體內(nèi)外抑瘤實驗結(jié)果均顯示PANI具有良好的抑瘤效果,作為光熱治療劑能快速殺滅癌細胞和消融腫瘤,在2周內(nèi)未見腫瘤復(fù)發(fā),PANI-PTT 組的小鼠存活率為83%。