韓雪影,李 露

(青島科技大學a.海洋科學與生物工程學院;b.化工學院,山東 青島266042)

檸檬酸又名枸櫞酸,其分子式為C6H8O7,外觀呈白色結(jié)晶性粉末、白色顆?；蛘呤菬o色半透明晶體[1],可用作防腐劑、增味劑、螯合劑、p H 調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑和穩(wěn)定劑等[2],在食品、化工、紡織、環(huán)保、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)有著廣泛的用途[3-4]。

已經(jīng)有許多微生物被報道能夠生產(chǎn)檸檬酸,包括細菌[5-7],霉菌[8-9]和酵母[10-12]等,但工業(yè)生產(chǎn)菌主要為黑曲霉和酵母菌。目前黑曲霉是工業(yè)中最常用的檸檬酸發(fā)酵菌株,但黑曲霉生長緩慢,發(fā)酵時間長,菌體形態(tài)不易控制,發(fā)酵時需富氧通氣等本身缺陷不易改變,因此尋求其他微生物用于檸檬酸發(fā)酵,酵母菌生長快速、無需富氧發(fā)酵,菌體形態(tài)不易變形,但發(fā)酵后副產(chǎn)物較多,遺傳改造困難,與黑曲霉相比檸檬酸產(chǎn)量較低。本課題利用代謝工程改造的大腸桿菌進行發(fā)酵,大腸桿菌生長快速、易于遺傳改造,無需富氧發(fā)酵,且大腸桿菌W 耐酸性較好,適合用于有機酸的生產(chǎn)。

在大腸桿菌中檸檬酸和衣康酸的代謝途徑極為相似,glt A基因和cad基因分別是檸檬酸和衣康酸生產(chǎn)的關(guān)鍵酶,glt A基因是衣康酸合成代謝途徑中的一環(huán),二者的區(qū)別在于有無cad基因的表達[13];cad基因在代謝途徑中跟檸檬酸的生產(chǎn)毫無關(guān)系,但在代謝工程改善衣康酸的生產(chǎn)過程中,glt A基因經(jīng)常被過表達以增加衣康酸的生產(chǎn)且效果明顯。如:通過自組裝技術(shù),在大腸桿菌Rosetta(DE3)中過表達了基因cad、glt A和ACN(烏頭酸酶),使衣康酸的產(chǎn)量得到了提高[14]。HARDER 等[15]以大腸桿菌MG1655 為宿主過表達了cad、glt A等基因,獲得了工程菌生產(chǎn)衣康酸的最高產(chǎn)量。但是cad基因的過表達對檸檬酸的代謝過程到底有何影響,卻很少有文獻報道。本研究在大腸桿菌W 中單獨過表達glt A基因和共表達glt A、cad基因,篩選獲得wg和wgc工程菌,通過搖瓶發(fā)酵對比檸檬酸產(chǎn)量,探索cad基因在大腸桿菌中過表達對檸檬酸產(chǎn)量的影響,為闡明檸檬酸和衣康酸代謝途徑之間的聯(lián)系奠定基礎。后續(xù)通過單因素試驗探索碳源、初始糖含量、溫度、p H、接種量和外源添加酵母膏等發(fā)酵條件對檸檬酸生產(chǎn)的影響。

1 實驗部分

1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

使用菌株DH5α為克隆宿主,大腸桿菌W(ATCC 9637)為表達宿主,所用質(zhì)粒為p CDFduet-1和p COLAduet-1,引物序列列于表1。cad基因序列來源于土曲霉(NCBI序列ID:BAG49047.1),由上海生工生物有限公司全基因合成并進行密碼子優(yōu)化;glt A基因序列來源于大腸桿菌W(NCBI序列ID:945323),從本實驗室已有菌株中擴增獲得。啟動子(tac和BBa_J23100)和終止子(BBa_B1001)的序列可從標準生物學部分注冊處(http://parts.igem.org)獲得。5＇UTR 由UTR 設計網(wǎng)站設計(http://sbi.postech.ac.kr/utr_designer)[16]。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primers sequence

1.2 重組菌株wg和wgc的構(gòu)建

使用Prime STAR(Takara)高保真酶,以帶有目的基因片段的質(zhì)粒為模板,通過PCR 擴增目的基因片段,以原始質(zhì)粒載體為模板,通過PCR 擴增載體片段。對回收純化后的基因片段和載體片段分別進行雙酶切,然后在T4連接酶(Takara)的作用下連接基因片段與質(zhì)粒片段,分別構(gòu)建基因表達載體。具體如下:

1)將glt A基因片段取代p COLADuet-1 質(zhì)粒上T7啟動子至終止子之間的片段,并使用啟動子元件PBBa_J23100啟動表達和終止子元件Ter BBa_B1001終止表達,啟動子和終止子通過引物設計加入到基因的兩端,構(gòu)建重組質(zhì)粒p COLA-glt A(圖1(a))。最后將構(gòu)建好的重組載體p COLA-glt A(圖1(a))通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌W,獲得重組菌株wg。

2)用cad基因片段取代p CDFDuet-1 質(zhì)粒上T7啟動子至終止子之間的片段,并使用啟動子元件tac啟動表達和終止子元件Ter BBa_B1001 終止表達,構(gòu)建重組質(zhì)粒pCDF-cad(圖1(a)),最后將構(gòu)建好的重組載體p CDF-cad(圖1(b))通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌wg,獲得重組菌株wgc。

圖1 重組質(zhì)粒pCOLA-gltA 和pCDF-cadFig.1 Recombinant plasmid pCOLA-glt A and p CDF-cad

1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

將陽性重組菌株用LB培養(yǎng)基(10.0 g·L－1胰蛋白胨、5.0 g·L－1酵母提取物和5.0 g·L－1NaCl)在37 ℃和150 r·min－1條件下培養(yǎng)12 h,然后按照4%的接種量接種至M9 培養(yǎng)基(12.8 g·L－1Na2HPO4·7H2O、3 g·L－1KH2PO4、0.5 g·L－1NaCl、1.0 g·L－1NH4Cl、0.5% 葡 萄 糖、2 mmol MgSO4、0.1 mmol CaCl2)[17],在37℃和200 r·min－1下生長至OD600值約為1.0 時,加入0.2 mmol·L－1IPTG 誘導蛋白的表達,最后在37 ℃,200 r·min－1條件下發(fā)酵96 h后收集發(fā)酵液。

1.4 分析方法

通過檢測發(fā)酵液在600 nm 處的光吸收來衡量菌體的生物量。利用HPLC 檢測發(fā)酵液中的檸檬酸和蔗糖[18]。色譜柱使用Aminex HPX-87 H 有機酸柱(25.0 cm,0.4 cm i.d.,Bio-Rad),流動相為5.0 mmol·L－1H2SO4,分析條件為:RID 檢測器,流速0.4 m L·min－1,柱溫65 ℃,進樣體積為10.0μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因glt A 和cad 對檸檬酸產(chǎn)量的影響

glt A(檸檬酸合酶基因)是檸檬酸合成不可或缺的基因,而cad基因的過表達從理論上來說能加速檸檬酸的消耗,使檸檬酸的含量降低,為了探索基因cad對檸檬酸產(chǎn)量的影響,將重組菌株wg、wgc于37 ℃,150 r·min－1條件下用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h,然后在4%的接種量,37 ℃,200 r·min－1條件下用M9培養(yǎng)基發(fā)酵5 d,以進行產(chǎn)量的對比。野生菌W 在相同條件下發(fā)酵,在發(fā)酵液中檢測不到檸檬酸,因此默認本實驗中野生菌不產(chǎn)檸檬酸,在此條件下進行數(shù)據(jù)處理和實驗分析,見圖2。第1 d開始wg和wgc表達菌株發(fā)酵液中檸檬酸的含量呈逐漸上升的趨勢,發(fā)酵到第4 d時檸檬酸含量達到最高,wg最高產(chǎn)量為150 mg·L－1,wgc最高產(chǎn)量為245 mg·L－1。第4 d之后檸檬酸含量開始下降,可能由于發(fā)酵液中糖分的消耗使得碳源通量降低。在相同時間點,菌株wgc檸檬酸的生產(chǎn)量全都高于wg菌株檸檬酸的產(chǎn)量,1～5 d wgc檸檬酸產(chǎn)量與wg檸檬酸產(chǎn)量的比值分別為2.5、1.9、1.8、1.6、2.1,wgc表達菌株生產(chǎn)檸檬酸的能力明顯比wg菌株更好,這表明cad基因的過表達有利于檸檬酸產(chǎn)量的提高,可能是因為cad基因的過表達進一步誘發(fā)或抑制了大腸桿菌機體內(nèi)檸檬酸相關(guān)的其它代謝途徑,導致檸檬酸的積累。

圖2 wg和wgc發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸Fig.2 Fermentation of wg and wgc to produce citric acid

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 不同碳源對檸檬酸產(chǎn)量的影響

為了探索不同碳源對重組菌株wgc發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的影響,將共表達cad、glt A的菌株在4%的接種量,37 ℃,200 r·min－1條件下分別置于4 g·L－1的蔗糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖中發(fā)酵培養(yǎng)4 d,結(jié)果見圖3。以蔗糖為碳源進行發(fā)酵所得發(fā)酵液中檸檬酸含量最高,明顯優(yōu)于其它糖類,達到0.63 g·L－1,檸檬酸產(chǎn)量提高了152%。使用果糖和麥芽糖作為碳源發(fā)酵檸檬酸含量較低,使用二糖發(fā)酵比單糖產(chǎn)量略高,因此確定二糖中的蔗糖為最適發(fā)酵碳源,并使用蔗糖進行后續(xù)發(fā)酵試驗。

圖3 碳源對檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of carbon source on the yield of citric acid

2.2.2 蔗糖濃度

底物蔗糖濃度對大腸桿菌的生長和檸檬酸的合成有著不可忽視的影響。蔗糖濃度過高會造成滲透壓高,發(fā)酵液黏度相應增加,從而影響傳質(zhì)速率,造成菌體生長延遲期的延長和比生長速率的降低,影響檸檬酸的合成速度。合適的糖濃度使檸檬酸產(chǎn)量高,殘?zhí)堑?糖酸轉(zhuǎn)化率高。將重組菌株wgc在4%的接種量,37 ℃,200 r·min－1條件下分別置于2、4、6、8 g·L－1的蔗糖中搖瓶96 h,考察蔗糖濃度對檸檬酸產(chǎn)量的影響見圖4。從圖4可看出,隨著蔗糖濃度的提高,檸檬酸產(chǎn)量逐漸增加,在蔗糖濃度8和10 g·L－1時獲得檸檬酸含量分別為1.36 和1.37 g·L－1,檸檬酸產(chǎn)量提高了約117%,但蔗糖的利用率較低,分別為24.4%和13.7%,為了減少碳源浪費,降低生產(chǎn)的成本,綜合考慮檸檬酸產(chǎn)量和蔗糖的利用率之后,選用8 g·L－1的蔗糖濃度進行發(fā)酵。

圖4 蔗糖濃度對檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of sucrose concentration on the yield of citric acid

2.2.3 發(fā)酵溫度

溫度影響著菌體的生長以及機體內(nèi)各種反應的進行,菌體最佳生長溫度和最佳發(fā)酵溫度可能有所不同,為了探索大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸適宜的發(fā)酵溫度,將重組菌株wgc置于4%接種量、8 g·L－1蔗糖、200 r·min－1和溫度分別為25、30、35、40和45℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)96 h,結(jié)果見圖5。溫度在25～35 ℃之間時,發(fā)酵液中檸檬酸含量呈現(xiàn)出隨溫度的升高而逐漸上升的趨勢,超過35℃后檸檬酸含量則逐漸下降,在35 ℃時檸檬酸含量最高,為1.37 g·L－1,檸檬酸產(chǎn)量提升不明顯。35℃與37℃檸檬酸產(chǎn)量差別甚微,考慮到已經(jīng)在發(fā)酵初期通過37℃發(fā)酵來提高生物量,選擇37℃作為后續(xù)工程菌生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵溫度。

圖5 溫度對檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of temperature on the yield of citric acid

2.2.4 p H

為了探索培養(yǎng)基初始p H 值對發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的影響,考察了4%接種量、8 g·L－1蔗糖、200 r·min－1、37 ℃和p H 6.0～8.0 時檸檬酸的含量,見圖6。由圖6所示,p H 在6.0～7.0的范圍內(nèi),p H的變化和檸檬酸產(chǎn)量變化呈正相關(guān),當p H 為7.0時,檸檬酸產(chǎn)量最高為1.41 g·L－1,產(chǎn)量與不控制p H 相比提升3%,p H 7.0～8.0時,檸檬酸呈下降趨勢,p H 為6.0 和8.0 時,檸檬酸產(chǎn)量較低,可能由于在酸性和堿性環(huán)境中影響大腸桿菌細胞的生長,為獲得較高檸檬酸產(chǎn)量,選擇p H 7.0進行后續(xù)發(fā)酵實驗。

圖6 p H 對檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of p H on the yield of citric acid

2.2.5 接種量

接種量是影響發(fā)酵的重要因素之一,一般來說接種量越大,起酵時間越短,降糖速率越高,也會導致菌體過快衰老,較低的接種量會使發(fā)酵過程緩慢,為了尋找合適的接種量,將重組菌株置于8 g·L－1蔗糖、200 r·min－1、溫度37 ℃、p H 7.0和接種量分別為2、4、6、8、10%的條件下發(fā)酵96 h,結(jié)果見圖7。如圖7所示,在接種量為2%和4%時,檸檬酸產(chǎn)量較高,在接種量4%時檸檬酸產(chǎn)量達到了最高為1.42 g·L－1,隨后產(chǎn)量快速下降,可能由于菌量過多,使蔗糖消耗過快,細胞內(nèi)碳通量下降,檸檬酸產(chǎn)量隨之下降。根據(jù)以上結(jié)果,選擇4%接種量進行檸檬酸后續(xù)的發(fā)酵實驗。

圖7 接種量對檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on the yield of citric acid

2.2.6 外源添加酵母膏量

為了探究有機氮源酵母膏對發(fā)酵的影響,將重組菌株wgc置于4%接種量、8 g·L－1蔗糖、200 r·min－1、溫度37 ℃、p H 7.0和酵母膏含量分別為0、1、2、3 g·L－1的條件下發(fā)酵96 h,結(jié)果見圖8。如圖8所示,外源添加酵母膏2 g·L－1時,獲得最高檸檬酸產(chǎn)量為0.26 g·L－1,但遠遠低于不添加酵母膏時檸檬酸的產(chǎn)量,原因可能是發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸時,大腸桿菌偏好吸收無機碳源,有機碳源的增加延長了菌群生長的時間,降低了產(chǎn)酸的效率,因此酵母膏的加入不利于檸檬酸產(chǎn)量的提高。綜上所述,單因素試驗確定的最佳發(fā)酵條件為蔗糖8 g·L－1、接種量4%、溫度37 ℃、p H 7.0。

圖8 酵母膏添加量對檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of the added amount of yeast extract on the yield of citric acid

2.2.7 發(fā)酵時間

在接種量4%、蔗糖8 g·L－1、溫度37 ℃、p H 7.0的條件下進行搖瓶發(fā)酵5 d,結(jié)果見圖9。第4天獲得最高檸檬酸產(chǎn)量為1.44 g·L－1,與優(yōu)化前相比檸檬酸產(chǎn)量提高了6倍左右。

圖9 發(fā)酵時間對檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of time on the yield of citric acid

3 結(jié) 論

1)構(gòu)建了生產(chǎn)檸檬酸的工程菌wg和wgc,實驗結(jié)果表明cad基因的過表達同樣也是增強工程菌檸檬酸合成的有效手段,可能是由于cad基因的過表達是加快了檸檬酸消耗,而檸檬酸作為三羧酸循環(huán)中重要的一環(huán),含量過低影響菌體正常代謝,因此cad基因的過表達可能加快了三羧酸循環(huán)速率,增加了檸檬酸的通量。

2)確定了工程菌wgc生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵工藝參數(shù):將單菌落在LB培養(yǎng)基中37℃、200 r·min－1下培養(yǎng)12 h,然后以4%接種量接種至含有8 g·L－1蔗糖、p H 為7.0的M9培養(yǎng)基中18 ℃低溫誘導24 h,然后轉(zhuǎn)至37 ℃發(fā)酵96 h后獲得了最高檸檬酸產(chǎn)量為1.44 g·L－1。