陳蔚燕

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院,山東 青島266109)

我國中草藥資源相當(dāng)豐富,目前使用的中藥已達5 000種左右,把各種藥材相配伍而形成的方劑,更是數(shù)不勝數(shù)。中草藥在我國消炎方面的用處已有很久的歷史,中草藥制劑具有成分多樣且結(jié)構(gòu)復(fù)雜、毒副作用較小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點[1-4]。中草藥作為殺菌抑菌劑也呈現(xiàn)出明顯的效果,而且有較大的開發(fā)潛力,在2020年新冠肺炎科研攻關(guān)和診療救治工作時,上海市衛(wèi)生健康委員會和上海市中醫(yī)藥管理局聯(lián)合發(fā)文,在提出的“要加快藥物研發(fā)進程,堅持中西醫(yī)結(jié)合、中西藥并用”的要求,要在新冠肺炎防治中充分發(fā)揮中醫(yī)藥作用,可見,中草藥制劑的臨床應(yīng)用價值巨大[5-9]。目前,中草藥在真菌的抑制、醫(yī)療及禽畜類飼料添加方面有研究[10-15],中草藥對種子萌發(fā)、土壤理化性質(zhì)、幼苗生長等方面也有重要影響[16-18]。有研究表明中草藥中的次生代謝物質(zhì)具有一定的植物調(diào)節(jié)活性[19-21],然而關(guān)于中草藥提取物應(yīng)用于植物調(diào)節(jié)作用的研究較少,因此,研究中草藥的提取物對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響,對中草藥進行全方位的研究有助于豐富中草藥數(shù)據(jù)。

有文獻報道過半枝蓮、木通、忍冬藤和連翹在傳統(tǒng)提取工藝下活性物質(zhì)的含量,并對其活性物的作用進行了研究[22-25],本研究采取微波提取方式對半枝蓮,木通,忍冬藤和連翹4味中草藥進行粗提取,研究其微波提取物對不同真菌的抑制效果,并以小麥種子為研究對象,研究提取液對小麥種子的促生作用,旨在為新型生物農(nóng)藥開發(fā)提供依據(jù),為中草藥利用提供新思路,更深入的去探索中藥的有效成分和價值。

連翹(Forsythia suspense),吉林;忍冬藤(Lonicera japonicaThunb),山東;半枝蓮(Barbed skullcap),江蘇;木通(Akebia quinate),湖北,均購于青島宏仁堂大藥房,磨細過孔徑0.150 mm 篩備用。

葡萄糖、瓊脂,均為分析純,阿拉丁試劑公司。柑橘炭疽病菌、棉花枯萎病菌、小麥全蝕病菌,以上3種植物病原真菌的菌種均從山東省農(nóng)業(yè)仿生應(yīng)用工程技術(shù)研究中心獲得。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高速萬能粉碎機,FW100型,天津市泰斯特儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋,LDZM-80KCS型,上海申安醫(yī)療器械廠;凈化工作臺,SW-CG-2FD型,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;微波萃取儀,MDS-8G 型,武漢中諾儀器有限公司。

1.2 實驗方法

微波提取方法:采用MDS-8G 型微波萃取系統(tǒng),根據(jù)文獻[26]的正交水平和因素,用表1和表2的設(shè)計進行微波萃取,萃取完成后,稍冷,旋蒸濃縮至干,備用。

表1 正交設(shè)計各因素Table 1 Factors of orthogonal design

表2 正交設(shè)計表Table 2 Orthogonal design table

1.3 抑菌活性測定方法

實驗采用抑制菌絲生長速率法來測定提取物的室內(nèi)抑菌活性[27]。在超凈工作臺上將培養(yǎng)基(帶藥),倒入直徑為6 cm 的培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板備用,并用4 mm 打孔器在事先準(zhǔn)備好的菌種邊緣打孔,用接種針把打好孔的活化菌接到制備好的培養(yǎng)皿內(nèi),每次重復(fù)處理3次,用塑料薄膜包好,放入恒溫27℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d左右,并做對照(20%乙醇)處理。待空白對照的菌落長滿平板的2/3時,用十字交叉法進行測量各個菌落直徑,并計算各藥劑對病菌的抑制率。本部分中草藥微波提取物的濃度均為8.00 mg·m L－1(用20%乙醇配置)。

半致死濃度EC50的測定:取連翹和忍冬藤的微波提取物加入滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基中,配制含藥濃度分別為1.00,2.00,4.00,6.00,8.00,10.00 mg·m L－1的含藥平板,采用上述的菌絲生長速率法測定抑菌活性。

1.4 生根活性測定方法

采取室內(nèi)瓊脂生根法進行[28]。挑選子粒大小均勻飽滿的種子,用相應(yīng)的藥劑溶液浸種處理10 h。藥劑浸種處理完后置于紙床上,放入全智能氣候植物箱中處理24 h,待種子主根露白而側(cè)根剛冒尖。同時制備出空白培養(yǎng)基,將催好芽的種子種在已經(jīng)凝固的培養(yǎng)基中,然后放入全智能氣候植物箱中繼續(xù)培養(yǎng),待到CK(清水對照)種子主根觸及杯底時用卡尺測量種子的主根、側(cè)根、莖高,每次重復(fù)處理3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel計算抑菌率的平均值及抑菌率,使用origin 8.0進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波提取條件下中草藥抑菌數(shù)據(jù)

2.1.1 微波提取條件下半枝蓮抑菌數(shù)據(jù)

半枝蓮微波提取液在8.00 mg·m L－1濃度下對真菌抑制結(jié)果見表3。從表3可以看出,半枝蓮在微波功率為800 W,提取時間為3 min,料液比(g·m L－1)為5∶100,溶劑為丙酮時,提取物濃度配置為8.00 mg·m L－1下,對柑橘炭疽真菌的抑菌率達到90.4%,對棉花枯萎真菌的抑菌率達到88.6%,對小麥全蝕真菌的抑菌率達到85.4%。從表3可以看出來,影響微波提取最大的因素是溶劑,可見不同溶劑的使用對微波提取物的抑菌效果產(chǎn)生了很大的影響。

表3 半枝蓮微波提取物(8.00 mg·mL－1)的抑菌數(shù)據(jù)Table 3 Antimicrobial data of microwave extracts from Forsythia suspensa(8.00 mg·m L－1)

2.1.2 微波提取條件下木通抑菌數(shù)據(jù)

木通微波提取液在8.00 mg·m L－1濃度下對真菌抑制結(jié)果見表4。從表4可以看出,在微波功率為400 W,提取時間為5 min,料液比為5∶70,溶劑為丙酮時,提取物濃度配置為8.00 mg·m L－1下,對柑橘炭疽真菌的抑菌率達到88.5%,對棉花枯萎真菌的抑菌率達到88.3%,對小麥全蝕真菌的抑菌率達到87.7%。從表4數(shù)據(jù)分析,影響微波提取最大的因素也是溶劑,即溶劑對提取液抑菌影響的較大。

表4 木通(8.00 mg·m L－1)微波提取物的抑菌數(shù)據(jù)Table 4 Bacteriostatic data of microwave extracts fromLonicera japonica(8.00 mg·m L－1)

2.1.3 微波提取條件下連翹抑菌數(shù)據(jù)

連翹微波提取液在8.00 mg·m L－1濃度下對小麥全蝕真菌抑制結(jié)果見表5。從表5可以看出,連翹微波提取物對小麥全蝕真菌和柑橘炭疽真菌的抑制效果較好,在溶劑為丙酮時,抑菌率均達到100%。

表5 連翹(8.00 mg·m L－1)微波提取物對XMQS的抑菌數(shù)據(jù)Table 5 Antimicrobial data of microwave extracts from Forsythia suspensa(8.00 mg·m L－1)

2.1.4 微波提取條件下忍冬藤抑菌數(shù)據(jù)

根據(jù)實驗方案選用3水平4因素正交設(shè)計,忍冬藤微波提取液在8.00 mg·m L－1濃度下對小麥全蝕真菌抑制結(jié)果見表6。其中從表6可以看出,在用丙酮作為溶劑時,忍冬藤微波提取物對3種真菌的抑菌率均達到了100%,可見,溶劑對本研究提取物的抑菌具有很大的影響。

表6 忍冬藤(8.00 mg·m L－1)微波提取物對XMQS的抑菌數(shù)據(jù)Table 6 Bacteriostatic data of microwave extracts from Lonicera japonica(8.00 mg·m L－1)

2.2 中草藥微波提取物最優(yōu)條件下抑菌效果

2.2.1 半枝蓮微波提取物最優(yōu)條件下抑菌效果

采用上述半枝蓮微波提取物的最優(yōu)條件,研究半枝蓮提取液的濃度分別在1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg·m L－16個濃度下對小麥全蝕真菌的抑制結(jié)果見圖1。從圖1可以看出,隨著濃度的增大,抑菌率升高,但擬合數(shù)據(jù)可以看出,數(shù)據(jù)并沒有很好的符合線性關(guān)系。

圖1 半枝蓮濃度對抑菌率的影響Fig.1 Effect of optimum concentration of Scutellaria barbata on Bacteriostatic rate

2.2.2 木通微波提取物最優(yōu)條件下抑菌效果

采用上述木通微波提取物的最優(yōu)條件,研究木通提取液的濃度 分 別在1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg·m L－16 個濃度下對小麥全蝕真菌的抑制結(jié)果見圖2。從圖2可以看出,隨著濃度的增大,抑菌率升高。

圖2 最優(yōu)條件木通濃度對抑菌率的影響Fig.2 Effect of the optimum concentration of Akebia quinate on the bacteriostatic rate

2.2.3 連翹微波提取物半致死濃度的求算

取連翹微波最優(yōu)方案提取液,在1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg·m L－16個濃度下對小麥全蝕真菌進行抑制。通過濃度對數(shù)X與抑菌率機率值Y的關(guān)系做出的線性回歸分析,見圖3。從圖3可以看出,當(dāng)R2＝0.977 3時,可得到線性回歸方程Y＝3.673 1X＋3.298 0。當(dāng)抑菌率機率值Y＝5時,可得到濃度對數(shù)X＝0.463 4,即EC50(有效中濃度)為2.91 mg·m L－1。從EC50來分析,連翹對小麥全蝕真菌抑制效果較好。

圖3 連翹濃度對數(shù)X 與抑制率機率值Y 的關(guān)系Fig.3 Relation between logarithm X of Forsythia suspensa concentration and probability Y of inhibition rate

2.2.4 忍冬藤微波提取物半致死濃度的求算

取忍冬藤微波最優(yōu)方案提取液,在1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg·m L－16 個濃度下對小麥全蝕真菌的抑制結(jié)果如圖4。從圖4可以看出來,忍冬藤丙酮提取液對小麥全蝕真菌都隨著濃度的提高抑制作用逐漸增強,當(dāng)濃度達到10.00 mg·m L－1時對小麥全蝕真菌都能達到97%以上。

從圖4可以看出,當(dāng)R2＝0.932 0時,可得到線性回歸方程Y＝3.219 4X＋3.566 5。當(dāng)抑菌率機率值Y＝5時,可得到濃度對數(shù)X＝0.445 3,EC50(有效中濃度)為2.79 mg·mL－1。從EC50來分析,忍冬藤丙酮微波提取物對小麥全蝕抑菌效果最好。

圖4 忍冬藤濃度對數(shù)X 與抑制率機率值Y 的關(guān)系Fig.4 Relation between logarithm X of Lonicera japonica concentration and probability Y of inhibition rate

2.3 生根活性數(shù)據(jù)

采取8.00 mg·m L－1的中草藥提取液進行稀釋200 倍液,對種子進行萌發(fā)生根,實驗數(shù)據(jù)見表7。從表7的數(shù)據(jù)可以看出,4種中草藥提取液對小麥種子的生根具有較強的促進作用,在主根長和側(cè)根長上,半枝蓮提取液的效果最高,主根促進率達到11.11%,側(cè)根長促進率達到9.81%。在種子的莖高上呈現(xiàn)出的促進作用并不明顯,甚至忍冬藤在莖高上出現(xiàn)了負增長。

表7 中草藥微波提取物對小麥種子生根數(shù)據(jù)Table 7 Effect of microwave extract of Chinese herbal medicine on rooting of wheat seeds

3 結(jié) 論

以4種中草藥為試材,以抑菌活性和生根活性為指標(biāo),采用微波提取方式進行提取,采用室內(nèi)抑制菌絲生長速率法對各個提取物進行抑菌實驗,采取瓊脂生根法對提取液進行生根活性測定,結(jié)果表明,4種中草藥提取物的抑菌活性在不同微波條件下抑菌率不等,忍冬藤微波提取物對3種真菌的抑制在丙酮作為溶劑時達到了100%,其中連翹微波提取物對小麥全蝕真菌的半致死率濃度為2.91 mg·m L－1,忍冬藤微波提取物對小麥全蝕真菌的半致死率濃度為2.79 mg·m L－1。半枝蓮微波提取物對柑橘炭疽真菌的抑菌率也可達90.4%,木通微波提取物對柑橘炭疽真菌的抑菌率可達88.5%,對小麥全蝕真菌的抑菌率可達87.7%。4味中草藥提取液對種子的萌發(fā)生根具有較強的活性,這項實驗的數(shù)據(jù)可以為中草藥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)殺菌劑提供有利的數(shù)據(jù)支持。