張玉珍，黃敏儀，陳可純，蔡永銘，楊祎琦

(廣東藥科大學(xué)，廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心，廣州 510006)

隨著社會(huì)的快速發(fā)展與人們生活水平的不斷提高，以高脂高糖飲食模式為代表的高熱能膳食已成為當(dāng)今普遍的飲食結(jié)構(gòu)，而人口老齡化問題也日益凸顯，衰老相關(guān)疾病的發(fā)生率也逐漸增加，給家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1]。2019年聯(lián)合國(guó)報(bào)告指出，到2050年全球老年人(65歲及以上)的人數(shù)將達(dá)16%[2]。研究證實(shí)，糖脂代謝異常在老年人中普遍存在，是人類心腦血管疾病重要的危險(xiǎn)因素，也是眾多難治眼病的高危因素[3]。隨著眼病患者數(shù)量的增加，視網(wǎng)膜損傷已成為眼病患者視力損害的主要原因，老年眼病已成為不可忽視的群體性疾病，但目前仍缺乏系統(tǒng)的臨床和基礎(chǔ)研究[4-5]。

糖脂代謝異常引起老年視網(wǎng)膜病變的機(jī)制較為復(fù)雜，主要涉及晚期糖基化終產(chǎn)物的積累、氧化還原穩(wěn)態(tài)受損、炎癥因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的產(chǎn)生及脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞焦亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等[6-9]。研究發(fā)現(xiàn)，血液循環(huán)中脂質(zhì)增多可引起視網(wǎng)膜內(nèi)脂質(zhì)積聚，可導(dǎo)致視網(wǎng)膜的功能減退，包括對(duì)視桿細(xì)胞、視錐細(xì)胞及雙極細(xì)胞的損傷，還可引起視網(wǎng)膜內(nèi)核層細(xì)胞排列紊亂，視網(wǎng)膜色素上皮層(the retinal pigment epithelium，RPE)離斷和紊亂[10-11]。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)為磷酸腺苷(AMP)的活化蛋白激酶，參與體內(nèi)多種代謝反應(yīng)及信號(hào)通路的調(diào)控，是研究糖尿病和其他代謝相關(guān)性疾病的重要靶點(diǎn)[12-13]。激活的AMPK參與抑制脂質(zhì)合成，其下游基因固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(SREBP1)和乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的磷酸化表達(dá)對(duì)促進(jìn)視網(wǎng)膜脂質(zhì)代謝發(fā)揮著重要作用[14-15]。研究表明，AMPK/SREBP/ACC信號(hào)是參與機(jī)體脂質(zhì)代謝的重要通路，通過上調(diào)AMPK或抑制SREBP/ACC表達(dá)可顯著改善棕櫚酸誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜脂質(zhì)沉積及組織損傷，但在高脂高糖膳食誘導(dǎo)的衰老動(dòng)物模型中視網(wǎng)膜損傷程度及機(jī)制有待進(jìn)一步研究[16-18]。本研究采用高脂高果糖長(zhǎng)期喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠，通過檢測(cè)SREBP1、p-ACC、p-AMPK等脂質(zhì)沉積相關(guān)蛋白表達(dá)的變化研究長(zhǎng)期高脂高果糖飲食對(duì)老年小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的影響，以期為進(jìn)一步闡明高脂高果糖飲食影響視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)改變的機(jī)制提供基礎(chǔ)，同時(shí)為老年眼病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 12只4周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，體重(18±2)g，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)：44007200052789)，飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)期間自由飲食飲水，12 h光照和12 h黑暗交替。

1.1.2 主要試劑及儀器 組織蛋白提取液購(gòu)自Thermo Scientific公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購(gòu)自Roche公司；BCA試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒購(gòu)自上海雅酶生物科技有限公司；SABC免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗購(gòu)自CST公司；SREBP1一抗購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology；p-ACC、p-AMPK、β-actin一抗購(gòu)自CST公司；DAPI購(gòu)自Yeasen Biotechnology。組織破碎儀(TissueLyser-Ⅱ)購(gòu)自QIAGEN公司；低溫高速離心機(jī)(H2050R-1)購(gòu)自上海華巖設(shè)備有限公司；蛋白電泳儀購(gòu)自Bio-Rad公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自BioRad公司；酶標(biāo)儀(Mithras LB940)購(gòu)自Berthold Technologies公司；顯微鏡(BX53)購(gòu)自O(shè)lympus公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 12只4周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，飼養(yǎng)至12月齡后，分為普通飲食組(ND)和高脂高果糖飲食組(HFHFD)，每組6只，分別給予普通飼料和高脂飼料，普通飲食組飼喂普通飼料(脂肪11.85%、蛋白質(zhì)23.07%、碳水化合物65.08%)，飲用純凈水；高脂高果糖飲食組飼喂高脂飼料(72%基礎(chǔ)飼料+24%豬油+2.4%豆油+1.3%膽固醇+0.3%膽鹽)，飲用果糖水(12.5%)。

1.2.2 樣品采集 普通飲食組和高脂高果糖飲食組小鼠飼養(yǎng)至18月齡時(shí)摘取眼球，左眼球在眼球固定液中固定24 h以上備用；右眼球―80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 視網(wǎng)膜組織HE染色 取出固定的眼球組織，然后按70%乙醇、75%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇及無水乙醇的濃度梯度脫水，用二甲苯進(jìn)行透明處理后置于石蠟中進(jìn)行包埋。將包埋好的組織按照4 μm厚度切片。切片常規(guī)脫蠟，依次置于無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇復(fù)水后，用超純水浸泡5 min清洗后進(jìn)行HE染色，脫水后使用中性樹膠封片，過夜風(fēng)干，于光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)。

1.2.4 p-ACC免疫組化染色 取固定的眼球組織，經(jīng)脫水、包埋、切片、脫蠟后，進(jìn)行IHC染色，染色步驟按SABC免疫組化試劑盒操作，其中p-ACC一抗按說明書推薦稀釋濃度(1∶1 000)進(jìn)行試驗(yàn)。中性樹膠封片，過夜風(fēng)干，于光學(xué)顯微鏡下觀察陽性染色情況并拍照，使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行p-ACC表達(dá)量統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 SREBP1免疫熒光 取固定的眼球組織，經(jīng)脫水、包埋、切片、脫蠟后，進(jìn)行抗原修復(fù)，將切片浸入TBS中，放入微波爐中加熱至沸騰，13 min后自然冷卻，用5% BSA在37 ℃封閉30 min，用SREBP1抗體(1∶250)4 ℃過夜孵育，PBS清洗后，用HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，PBS清洗后用DAPI封片，于熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)強(qiáng)度及SREBP1的分布情況，使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行SREBP1表達(dá)量統(tǒng)計(jì)。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)蛋白的表達(dá) 取凍存的眼球組織，加入一定量含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清，按BCA試劑盒說明書操作，測(cè)定組織蛋白含量并定量。每組取等量蛋白上樣，采用6% SDS-PAGE分離蛋白，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h，TBST洗膜，5%脫脂牛奶常溫封閉2 h，TBST洗膜，加入一抗p-AMPK(1∶1 000)、p-ACC(1∶1 000)、SREBP1(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶3 000)，常溫孵育1 h，TBST洗膜，顯影拍照，用Image Lab 4.0軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度值統(tǒng)計(jì)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果

由圖1可知，普通飲食組的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰，從內(nèi)到外依次可見內(nèi)界膜、神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層、內(nèi)顆粒層、外網(wǎng)狀層、外顆粒層、視桿和視椎層、色素上皮層，各層排列緊密，界限清晰，厚度正常，細(xì)胞形態(tài)正常，未見明顯異常；高脂高果糖飲食組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)被破壞，視桿和視椎層厚度不均勻，局部增生，延伸入外顆粒層，局部變薄，外顆粒層厚度不均勻，局部增厚，且細(xì)胞排列疏松。

2.2 p-ACC免疫組化染色結(jié)果

由圖2可知，在視網(wǎng)膜中，p-ACC主要在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、外叢狀層和感光細(xì)胞內(nèi)段表達(dá)，與普通飲食組相比，高脂高果糖飲食組小鼠視網(wǎng)膜中p-ACC的表達(dá)降低。p-ACC表達(dá)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),與普通飲食組相比，高脂高果糖飲食組p-ACC蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05，圖3)。

*，差異顯著(P<0.05)。圖5、6同

2.3 SREBP1免疫熒光染色結(jié)果

由圖4可知，與普通飲食組相比，高脂高果糖飲食組SREBP1的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，且外核層亦出現(xiàn)較大空洞，細(xì)胞核排列紊亂，各層次界限變模糊。SREBP1表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，與普通飲食組相比，高脂高果糖飲食組SREBP1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05，圖5)。

圖4 各組視網(wǎng)膜組織中SREBP1的免疫熒光染色(400×)

圖5 各組視網(wǎng)膜組織中SREBP1的相對(duì)表達(dá)量

2.4 能量代謝樞紐信號(hào)通路蛋白表達(dá)結(jié)果

由圖6可知，與普通飲食組相比，高脂高果糖飲食組小鼠視網(wǎng)膜中p-ACC和p-AMPK蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，SREBP1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

A，各蛋白Western blotting條帶；B，各蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

視網(wǎng)膜位于眼球壁的內(nèi)層，內(nèi)側(cè)是玻璃體，外側(cè)是脈絡(luò)膜，具有極其復(fù)雜的多層結(jié)構(gòu)和大量具有微回路特征和不同功能的細(xì)胞，在視覺成像中起著至關(guān)重要的作用[19-20]。正常的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰，各層次界限分明，視網(wǎng)膜厚度不均、增厚或變薄，細(xì)胞形態(tài)異常、排列疏松等都會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能損傷[21]。本研究HE染色結(jié)果顯示，高脂高果糖飲食可以使視網(wǎng)膜中細(xì)胞排列疏松，視桿視椎層和外顆粒層局部變薄，還可以使視桿視椎層局部增厚并延伸入外顆粒層，外顆粒層局部也有增厚，表明高脂高果糖飲食可導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能損傷。

視網(wǎng)膜功能與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，不同的脂代謝紊亂可能導(dǎo)致不同的視網(wǎng)膜病變[22-23]。如視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈阻塞性疾病是由高膽固醇和高甘油三酯血癥所引起，而視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞病變主要是由血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和載脂蛋白B等升高所引起的[24]。研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食引起的代謝異?？梢杂绊懷鄄垦簞?dòng)力，對(duì)視網(wǎng)膜形態(tài)和功能有著不可逆轉(zhuǎn)的損傷[25]，這與本研究結(jié)果一致，即高脂高果糖飲食可以增加脂質(zhì)沉積、破壞視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)形態(tài)。

ACC是脂肪酸代謝的限速酶，激活的AMPK可以促進(jìn)ACC磷酸化，發(fā)揮調(diào)控脂質(zhì)代謝的作用[26-27]。本研究IHC結(jié)果顯示，與普通飲食組相比，高脂高果糖組老年小鼠視網(wǎng)膜組織外叢狀層的p-ACC蛋白表達(dá)量顯著降低，說明高脂高果糖飲食可以改變p-ACC表達(dá)，引起視網(wǎng)膜外叢狀層細(xì)胞排列紊亂及外叢狀層脂質(zhì)沉積。AMPK激活后可下調(diào)SREBP1表達(dá)，抑制脂肪酸合成[28-29]。SREBP1是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控脂類代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)控膽固醇和脂肪酸合成中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)[30]。本研究免疫熒光結(jié)果顯示，與普通飲食組相比，高脂高果糖飲食的老年小鼠視網(wǎng)膜組織中SREBP1過度表達(dá)，導(dǎo)致組織局部發(fā)生脂質(zhì)沉積，導(dǎo)致外核層出現(xiàn)空洞。AMPK可以通過磷酸化ACC使ACC失去活性，從而抑制脂肪合成，促進(jìn)脂肪酸氧化，降低脂質(zhì)堆積，而高脂可增加ACC表達(dá)，p-ACC蛋白表達(dá)水平降低，脂肪合成增加，引起視網(wǎng)膜的損傷[31]。本研究結(jié)果顯示，與普通飲食組相比，高脂高果糖誘導(dǎo)的老年小鼠視網(wǎng)膜組織AMPK的活化顯著受到抑制，p-ACC表達(dá)降低，SREBP1表達(dá)增加，導(dǎo)致脂質(zhì)沉積增加而損傷視網(wǎng)膜，提示在研究高脂高果糖喂養(yǎng)動(dòng)物時(shí)，也要關(guān)注其眼部疾病的變化。

4 結(jié) 論

高脂高果糖飲食可降低視網(wǎng)膜組織中p-AMPK和p-ACC蛋白表達(dá)，增加SREBP1蛋白表達(dá)，引起脂質(zhì)沉積，使視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列疏松、視網(wǎng)膜厚度不均勻，局部增生，導(dǎo)致視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，功能受損。結(jié)果可為研究高脂高果糖誘導(dǎo)的老年患者視網(wǎng)膜病變提供參考。