張振宇，王 勇

(1.河南省濟源市畜產品質量監(jiān)測檢驗中心，濟源 459000；2.河南省信陽市畜產品質量檢驗監(jiān)測中心，信陽 464000)

黃曲霉毒素(aflatoxin，AF)是Ⅰ類致癌物質，飼料很容易被黃曲霉毒素污染[1]，奶牛在攝入含有黃曲霉毒素的飼料后，會導致奶牛出現(xiàn)免疫力下降和營養(yǎng)不良等問題，給奶農帶來嚴重損失[2-3]。黃曲霉毒素主要有B族(AFB1、AFB2)、M族(AFM1、AFM2)和G族(AFG1、AFG2)，其中AFB1在所有的黃曲霉毒素中毒性最強，AFM1會以AFB1的代謝物形式進入生乳與乳制品中，AFB1作用的靶器官是肝臟，是導致肝癌形成的主要致癌物質之一[4-5]。目前常見的檢測黃曲霉毒素殘留方法有質譜法[6]、電化學法[7-8]、光譜法[9]、色譜法[10-11]、試紙條法[12]等。作者介紹了近5年來國內外上述方法在檢測乳與乳制品中黃曲霉毒素殘留中的應用。

1 質譜法

質譜法具有檢測精度高、重現(xiàn)性好等特點，因此GB 5009.24—2016《食品中黃曲霉毒素M族的測定》與GB 5009.22—2016《食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》均采用了質譜法來檢測黃曲霉毒素。借助黃曲霉毒素的同位素內標物可以實現(xiàn)黃曲霉毒素的精準分析，質譜法是科研工作者在對黃曲霉毒素定量分析時的首選檢測方法。

合適的前處理方法可以提高質譜法檢測黃曲霉毒素的準確度，目前的研究都集中在尋找適當?shù)奶崛﹣硖崛∪榕c乳制品中的黃曲霉毒素。宗萬里等[13]開發(fā)了一種無需免疫親和柱凈化與濃縮步驟的前處理方法，通過在液態(tài)乳中加入乙腈渦旋振蕩離心，上清液過濾后直接進質譜檢測AFM1，該法成本低、速度快，適合大批量樣品的快速檢測。Zhang等[14]合成了一種新型、特異性的誘導劑功能化的吸附劑，當向牛奶樣品中加入該吸附劑與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基丁二酰亞胺(EDC/NHS)后，吸附劑可以特異性地與AFM1結合，通過固相萃取柱萃取與洗脫后便可以進行質譜檢測。華宇等[15]使用MycoSepTM226 AflaZon+Multifunctional凈化柱來凈化通過甲醇提取的乳與乳制品樣品上清液，并利用同位素內標進行基質校正，該法凈化過程快速，檢驗效率得到了很大的提升。Du等[16]分別使用十八烷基三甲氧基硅烷功能化的二氧化硅顆粒和甲醇作為吸附劑和解吸溶劑來凈化、富集牛奶中的AFM1和AFB1，在使用質譜對AFM1和AFB1殘留進行檢測時均取得了良好的結果。Mehta等[17]使用含2%甲酸的低溫乙腈來提取牛奶中的AFM1、AFM2、AFB1、AFB2、AFG1和AFG2殘留，在經過10 min的水浴與5 min的低溫冷藏后，通過離心、干燥、復溶等步驟得到上機溶液，利用超高效液相色譜串聯(lián)質譜的選擇反應監(jiān)測模式來檢測黃曲霉毒素殘留。曹葉中等[18]開發(fā)了一種快速、廉價的前處理方法用于提取、凈化乳與乳制品中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1，使用含0.5%乙酸的乙腈-水溶液作為提取溶劑，通過加入硫酸鎂和氯化鈉來促進乙腈-水分層，最后利用正己烷除脂便可用液相色譜串聯(lián)質譜儀進行檢測。張俊等[19]使用甲醇提取牛奶樣品中的AFM1，經過渦旋、離心、水稀釋后利用免疫親和柱進行凈化，以乙腈或甲醇作為洗脫劑，在優(yōu)化的試驗條件下，試驗結果可以滿足乳中AFM1檢測的靈敏性需求。除了直接檢測黃曲霉毒素，還可以通過其他方法間接定量黃曲霉毒素。Pérez等[20]利用電感耦合等離子體質譜開發(fā)了一種免疫分析方法用于檢測牛奶中的AFM1，該法基于間接生物素化的抗體和與鏈霉菌素結合的金納米粒子，當體系變成酸性時，金納米粒子游離出來從而被電感耦合等離子體質譜檢測，從而間接得到AFM1的定量信息。以上各種方法的線性范圍、檢出限和回收率見表1。

表1 不同質譜法在檢測黃曲霉毒素中的線性范圍、檢出限和回收率

在使用免疫親和柱、黃曲霉毒素同位素內標物和質譜法檢測乳與乳制品中的黃曲霉毒素時，能獲得專一、精確的檢測結果，但黃曲霉毒素同位素內標物價格不菲，免疫親和柱同樣造價昂貴，不適合大批量乳與乳制品中黃曲霉毒素的分析檢測。因此質譜法檢測黃曲霉毒素的研究重點可聚焦外標法、普通固相萃取柱或者磁性吸附材料的開發(fā)。

2 電化學法

電化學法具有所用儀器簡便、成本低、速度快、靈敏度高等優(yōu)點，廣泛應用于環(huán)境、生物、食品檢測等領域[21]。電化學法檢測黃曲霉毒素多采用間接法，思路之一是黃曲霉毒素與適配體結合成復合物，從而阻礙電極表面電子的傳遞，導致電化學傳感器的電阻變大，借此實現(xiàn)對黃曲霉毒素的定性定量分析[22]；思路之二是在電極表面固定可發(fā)生氧化還原反應的物質，當體系中存在黃曲霉毒素時，黃曲霉毒素可將發(fā)生氧化還原反應的物質置換出來，從而間接檢測黃曲霉毒素[23]。

Ahmadi等[24]分別將還原氧化石墨烯、金納米顆粒(AuNPs)通過循環(huán)伏安法固定到鉛筆芯電極表面，然后在經過硫醇改性的適配體溶液中放置60 min得到電化學傳感器，該傳感器在AFM1存在時電阻會增加，因此可以借助電化學阻抗法來實現(xiàn)對AFM1的檢測。Smolko等[25]將玻碳電極(glassy carbon electrode，GCE)置于含中性紅(neutral red,NR)、硝酸鉀與十羧基苯甲酸基柱芳烴(P[5]A-COOH)溶液中采用循環(huán)伏安法循環(huán)掃描19.5圈，然后用EDC/NHS將AFM1適配體固定到電極表面制得了一支可特異性檢測AFM1的電化學傳感器。Shadjou等[26]把石墨烯量子點(GQDs)、α-環(huán)糊精(α-CD)和銀納米粒子(AgNPs)固定到玻碳電極表面，然后利用循環(huán)伏安法檢測AFM1，當AFM1濃度增大時，電流值也相應得到增加，在檢測乳中AFM1時效果令人滿意。Hamami等[27]在絲網印刷電極(screen-printed carbon electrode，SPCE)表面首先固定上AuNPs，然后固定二茂鐵四乙二醇配體(ferrocenetetraethylene glycol ligand，F(xiàn)cTGL)，最后在EDC/NHS的作用下修飾AFM1適配體，借助電化學阻抗法實現(xiàn)了AFM1的靈敏分析。Rahmani等[28]采用靜電紡絲和熱處理的方法制備了靜電紡絲碳納米纖維，并將其直接用作新型襯底電極，接著利用電沉積的方法將AuNPs固定到電極表面，最后將經過硫醇修飾的單鏈DNA修飾到電極表面制得了可特異性檢測AFM1的電化學傳感器。Abera等[29]使用電路板打印機分別將銀糊制作的工作電極和對電極與銀/氯化銀糊制作的參比電極打印在125 μm厚的聚對苯二甲酸乙二醇酯基片上，在120 ℃條件下固化15 min后，使用噴霧沉積裝置將單壁碳納米管(single-walled carbon nanotube,SWCNTs)均勻地噴涂在工作電極的頂部，最后固定上適配體后制備了一支檢測AFM1的電化學傳感器。Aissa等[30]利用基于二茂鐵和硅納米粒子(SiNPs)的適配體、絲網印刷電極構建了一支可以靈敏檢測AFM1的電化學傳感器，在利用循環(huán)伏安法與電化學阻抗法檢測牛奶中的AFM1時效果良好。Karczmarczyk等[31]首先通過自組裝原理將巰基丙酸固定到覆金的絲網印刷電極表面，接著在EDC/NHS作用下固定牛血清蛋白-AFM1結合物，最后將電極在乙醇胺溶液中浸泡去除未結合的牛血清蛋白-AFM1，該傳感器可用于牛奶中AFM1的靈敏度檢測。表2是以上電化學法在檢測黃曲霉毒素應用中的線性范圍、檢出限和回收率。電化學法在檢測乳與乳制品中的AFM1時具有靈敏度高、線性范圍寬、檢出限低、耗費低等優(yōu)點，但不容忽視的是電化學法的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性較差，而且難以實現(xiàn)多種黃曲霉毒素的同時檢測。

3 光譜法

目前已有研究人員使用光譜法來檢測食品中的黃曲霉毒素，如熒光光譜法[32]、紅外光譜法[33]，隨著研究的深入，熒光光譜法、紅外光譜法都被用于檢測乳與乳制品中的黃曲霉毒素，且取得了良好的結果。

3.1 熒光光譜法

Li等[34]利用簡單的水熱法合成了高發(fā)光率氮摻雜的碳點，其量子產率達到97.1%，通過使用合成的碳點和堿性磷酸酶研制了一種基于碳點內濾效應的無標記免疫傳感器，用于牛奶中AFM1的超靈敏度檢測，檢出限低至0.0186 ng/mL，線性范圍為79.6%～112.5%，高量子產率的碳點對提高傳感器的靈敏度起到了重要的作用。郭婷等[35]將羧基熒光素修飾的適配體作為識別元件，使用具有猝滅性和磁分離性能的磁性Fe3O4納米材料作為熒光猝滅劑，當體系中存在AFM1時，羧基熒光素修飾的適配體從Fe3O4表面脫附，使體系的熒光信號增強，基于此來檢測牛奶中的AFM1，該法對AFM1的檢出限為0.02 μg/L，線性范圍為0.05～0.70 μg/L，在檢測牛奶樣品中AFM1的回收率為82.5%～102.3%。Li等[36]通過晶種生長法合成了尺寸為33 nm的鈀納米粒子，基于5-羧基熒光素和鈀納米粒子之間的熒光共振能量轉移建立了檢測AFM1的方法，整個體系使5-羧基熒光素熒光猝滅最大程度達到95%，而且鈀納米粒子對熒光素的非特異性熒光猝滅作用可以忽略不計，優(yōu)化試驗條件后，AFM1的檢出限為1.5 pg/mL，線性范圍為5～150 pg/mL,在檢測牛奶樣品中AFM1的回收率為92.0%～106.5%。Jia等[37]利用季胺化四苯基乙烯鹽、氧化石墨烯和AFB1適配體構建了一支無標記的熒光適配體傳感器，該傳感器對AFB1的檢出限為0.25 ng/mL，線性范圍為0～3 ng/mL，在檢測牛奶中的AFB1時線性范圍為91.36%～91.89%，該法無需熒光素進行標記，簡化了試驗流程。Guo等[38]首先利用羧基熒光素標記核酸適配體，然后加入氧化石墨烯用來熄滅羧基熒光素標記核酸適配體的熒光，氧化石墨烯還可以保護核酸適配體不被核酸酶裂解，當加入AFM1后，AFM1會與適配體結合形成復合物從而導致適配體從氧化石墨烯表面脫離，在酶的作用下核酸適配體裂解，熒光素標記的核酸適配體重新發(fā)光，實現(xiàn)了信號放大，AFM1的線性范圍為0.2～10 μg/kg，檢出限為0.05 μg/kg，方法的回收率在92%～126%。Niazi等[39]將KYF4:Eu3+時間分辨熒光納米顆粒作為信號探針，石墨相氮化碳(g-C3N4)納米片作為熒光猝滅劑，并結合滾環(huán)擴增技術提高檢測的靈敏度，檢出限達到了0.0194 pg/mL，線性范圍為0.0001～0.5 ng/mL，線性范圍為92.0%～99.8%，在AFB1與AFB2同時存在的條件下，AFM1的檢測基本不會受到干擾，具有良好的抗干擾能力。Zhou等[40]合成尺寸為150 nm的量子點珠作為競爭抗原的載體，大尺寸的量子點珠可以降低競爭抗原對抗體的結合親和力，進而增強熒光信號強度，使用AFB1與牛血清蛋白在量子點珠表面進行標記，結合酶聯(lián)免疫與熒光法來檢測巴氏消毒奶、酸奶和奶粉中的AFM1，檢出限分別為0.5、0.6、0.72 pg/mL。Qiao等[41]利用羧基熒光素修飾核酸適配體，其互補DNAs使用羧基四甲基羅丹明淬滅基團修飾，在沒有AFM1的情況下，核酸適配體和互補DNAs雜交，由于核酸適配體的熒光基團靠近互補DNAs的猝滅基團，導致核酸適配體的熒光猝滅，當加入AFM1后，AFM1與核酸適配體形成結合物，核酸適配體結構的改變導致熒光信號出現(xiàn)，在最佳的試驗條件下，AFM1的檢出限為0.5 ng/mL，線性范圍為1～100 ng/mL，在檢測牛奶樣品中AFM1的回收率為93.4%～101.3%。

3.2 紅外光譜法

Jha等[42]通過使用傅里葉變換紅外分光光度計檢測分別添加10、20、30、40、50 μL/L AFB1的牛奶樣品，發(fā)現(xiàn)在1 484～1 423 cm-1的波數(shù)范圍內可以明顯觀察到吸光度的變化，基于此，結合化學計量學建立了定量檢測AFB1的方法。該研究小組使用同樣的方法研究了紅外光譜法在檢測AFM1中的應用，試驗發(fā)現(xiàn)在1 800～650與3 689～3 499 cm-1波數(shù)范圍內，空白牛奶與添加了AFM1的牛奶的光譜圖存在顯著差異，該法可檢測濃度低至0.02 μg/L的AFM1[43]。紅外光譜法檢測黃曲霉毒素無需對樣品進行前處理，僅需制片便可進行檢測，與質譜儀和色譜儀相比，紅外光譜儀價格也更便宜，研究人員可進一步探索合適的紅外光譜法用于檢測黃曲霉毒素。

3.3 其他光譜法

Lerdsri等[44]基于局域表面等離子體共振原理，結合AuNPs研制了一種無標記的比色傳感器用于檢測AFM1，該傳感器在氯化鈉存在的條件下利用適配體與AFM1和AuNPs的聚集效應，由聚集AFM1的體系表面等離子體共振峰移導致溶液由紅色變成紫色乃至深藍色，可以用比色法測定樣品中的AFM1，該傳感器的檢出限為0.002 ng/mL，線性范圍為0.005～0.100 ng/mL，在檢測牛奶中AFM1的回收率為80.5%～89.7%。Fang等[45]使用鏈霉親和素來鏈接生物素化的AFM1單克隆抗體與生物素化的氧化石墨烯，在葡萄糖與I-發(fā)生氧化反應后，生成的I2蝕刻十六烷基三甲基溴化銨標記的金納米棒導致局域表面等離子體共振峰發(fā)生改變，使溶液的顏色從藍色變成粉色，在使用紫外光譜法檢測AFM1時檢出限為0.11 ng/mL，線性范圍為0.25～10 ng/mL，回收率為90.33%～102.02%，該法具有良好的特異性及準確度。Jalalian等[46]以適配體作為識別探針，AuNPs作為比色指示劑，基于鏈霉親和素包覆的二氧化硅納米顆粒、AuNPs和適配體的互補鏈設計了一種比色適體傳感器，在此方法中，AFM1適配體及其互補鏈均通過鏈霉親和素與生物素之間的相互作用附著在二氧化硅納米顆粒表面，當溶液中存在AFM1時顏色為紅色，隨著AFM1濃度的降低，溶液顏色會逐漸變?yōu)樽仙摲z測AFM1時線性范圍較寬，達到了300～75 000 ng/L，對檢測高、低濃度的AFM1殘留均有效，檢出限為30 ng/L。Tsounidi等[47]研制了一種基于白光反射光譜的微型光學免疫傳感器用于奶樣品中AFM1的快速免標記檢測，白光反射光譜傳感系統(tǒng)由測量裝置和生物芯片組成，測量裝置包括反射探針、光源和光譜儀，生物芯片是固定AFM1-牛血清蛋白結合物的SiO2層的硅芯片，該法檢出限為6 pg/mL，線性范圍為0.012～2.0 ng/mL，該法可檢測不同動物品種的加工和未加工奶中的AFM1，且樣品不需稀釋。

光譜法在檢測乳與乳制品中黃曲霉毒素時具有特異性高、檢測速度快等優(yōu)點，但是其適體傳感器制作步驟繁瑣、需要使用DNA試劑等限制了光譜法在檢測乳與乳制品中黃曲霉毒素的應用。

4 色譜法

GB 5009.22—2016《食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》中采用了高效液相色譜-柱前衍生法、高效液相色譜-柱后衍生法以及薄層色譜法來檢測食品中的AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，GB 5009.24—2016《食品中黃曲霉毒素M族的測定》同樣利用高效液相色譜法來檢測AFM1和AFM2。目前已有研究人員開發(fā)了液相色譜法用于檢測乳與乳制品中的黃曲霉毒素[48-49]。

Hamed等[50]結合分散液液微萃取和QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)技術，利用高效液相色譜-熒光法開發(fā)了同時檢測乳與乳制品中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的方法，并研究了該方法對8種不同的乳與乳制品中黃曲霉毒素檢測效能，在優(yōu)化的試驗條件下，方法的回收率為82%～104%。Shuib等[51]首先使用AFLATEST免疫親和柱去除樣品中的AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，然后利用Hypersil gold C18柱分離AFM1，結果發(fā)現(xiàn)，當甲醇代替乙腈作為流動相時，AFM1的峰面積提高了67%，在使用柱后光化學衍生法檢測AFM1時檢出限從0.013 μg/L降至0.002 μg/L，線性范圍為0.004～0.500 μg/L。Shuib等[52]利用注射器內分散微固相萃取-高效液相色譜-熒光法建立了一種同時檢測AFB1、AFB2、AFM1和AFM2的方法，該法使用Hypersil gold C18色譜柱在40 ℃條件下對黃曲霉毒素進行分離，在優(yōu)化的試驗條件下，4種黃曲霉毒素可在35 min內完全分離，檢出限分別為0.005、0.003、0.004、0.004 ng/mL，回收率為73.0%～109.6%。

色譜法在檢測乳與乳制品中黃曲霉毒素的應用中具有前處理簡便、可同時檢測等優(yōu)點，但色譜法也存在檢測時間長、低濃度黃曲霉毒素的峰形不好等缺點，以后可重點研究尋找合適的流動相用于分離黃曲霉毒素。

5 試紙條法

試紙條法具有特異性好、檢測費用低、檢測時間短等優(yōu)點，在食品檢測、生物與生命分析等領域有著十分重要的應用。在檢測乳與乳制品中的黃曲霉毒素時，試紙條法可在現(xiàn)場進行大批量樣品的篩查，當出現(xiàn)陽性樣品時再利用質譜法進行確認，可極大地提高檢測效率并降低檢測費用。

Su等[53]利用紅色的聚乙烯亞胺/聚苯乙烯磺酸鈉((PEI/PSS)4)復合二氧化硅納米顆粒標記AFM1單克隆抗體制作了免疫層析檢測試紙條用于牛奶中AFM1的靈敏檢測，在優(yōu)化單克隆抗體的條件與免疫探針的用量后，該試紙條在檢測牛奶中AFM1的檢出限低至0.1 pg/mL，具有優(yōu)秀的靈敏度。Han等[54]制備了特異性的單克隆抗體和受體，并與AuNPs結合形成8個抗體/受體偶聯(lián)物作為檢測探針，然后合成了8個相應的半蛋白偶聯(lián)物，并將其固定在硝化纖維素膜上作為捕獲抗原，實現(xiàn)了一支試紙條可同時檢測8種藥物殘留，在檢測AFM1時檢出限為0.016 ng/mL。Li等[55]利用時間分辨熒光微球免疫層析試紙條快速檢測乳與乳制品中的AFM1，用聚苯乙烯微球包封熒光納米微球銪(Ⅲ)作為標簽，然后將其結合到單克隆抗體上，在優(yōu)化的試驗條件下，半數(shù)抑制濃度為0.204 ng/mL，檢出限為0.019 ng/mL，隨著AFM1含量的增加，檢測線的熒光強度降低，該法的線性范圍為0.05～2.0 ng/mL。蔡芬等[56]制備了膠體金單克隆抗體復合物，使用包被原作為T線，羊抗鼠二抗作為C線，在優(yōu)化了偶聯(lián)過程抗體的添加量和偶聯(lián)過程偶聯(lián)pH后用于檢測牛奶樣品中的AFM1，線性范圍為0.01～1.00 μg/L，檢測限為0.05 μg/L，檢測時間為10 min。Kasoju等[57]基于微流控紙的分析裝置制備了免疫試紙條用于檢測牛奶中的AFM1，方法使用未修飾的AuNPs作為探針、21-mer適配體作為識別分子，在沒有AFM1的情況下，即使在高鹽濃度下，游離適配體也能吸附在AuNPs表面，當存在AFM1時，鹽能夠誘導特異性適配體聚集，在最佳試驗條件下檢測牛奶中的AFM1時，檢出限為10 nmol/L，活性長達3個月。

試紙條法檢測乳與乳制品中黃曲霉毒素時無需對樣品進行繁瑣的前處理，也不需要專用的儀器，而且檢測時間非常短，對檢測人員要求較低，因此十分適合大批量樣品的快速篩查及現(xiàn)場檢測。但試紙條法適合定性檢測，定量檢測性能的欠缺限制了試紙條法的發(fā)展，今后試紙條法與讀數(shù)儀相結合是發(fā)展的趨勢[58]。

6 其他方法

Giovanni等[59]開發(fā)了一種直接檢測全脂牛奶中微量AFM1的傳感器檢測方法，首先合成了AFM1單克隆抗體，然后將單克隆抗體與釀酒酵母菌的轉化酶結合，當牛奶中存在AFM1時，釀酒酵母菌的轉化酶被置換出來，把蔗糖轉化成果糖和葡萄糖，可通過血糖計測量產生的葡萄糖來間接實現(xiàn)AFM1的定量檢測，該法可檢測最低濃度為27 μL/mL的AFM1。Yao等[60]以辣根過氧化物酶催化魯米諾化學發(fā)光反應為基礎，使用雜交鏈式反應信號放大策略用于提高檢測靈敏度，磁性材料分離技術的應用可以進一步降低背景信號，在使用化學發(fā)光法檢測AFM1時，線性范圍為0.5～40 ng/mL，檢出限為0.2 ng/mL，在檢測牛奶樣品中AFM1的回收率為98.2%～104.4%。

7 展 望

以上綜述了質譜法、電化學法、光譜法、色譜法、試紙條法等在檢測乳與乳制品中黃曲霉毒素的最新研究進展，表3總結了以上各種方法在檢測乳與乳制品中黃曲霉毒素中的優(yōu)勢及其面臨的挑戰(zhàn)。

表3 不同方法在檢測乳與乳制品中黃曲霉毒素的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)

開發(fā)新的檢測乳與乳制品中黃曲霉毒素的方法可以包括以下幾個方面：①開發(fā)特異性好、靈敏度高的試紙條用于樣品初篩，并將試紙條與讀數(shù)儀結合，可快速、簡便地得到乳與乳制品中黃曲霉毒素的殘留量，實現(xiàn)在線快速檢測，在原料乳驗收時進行快速判定具有重大意義；②精準檢測方面，開發(fā)不需要免疫親和柱的前處理方法用于分離和富集乳與乳制品中的黃曲霉毒素，利用質譜法與色譜法便于實現(xiàn)自動化的優(yōu)勢可以大批量精確定量乳與乳制品中黃曲霉毒素；③開發(fā)性能穩(wěn)定、制作方法簡單的適配體傳感器和修飾電極分別用于光譜法和電化學法來檢測乳與乳制品中的黃曲霉毒素，可以顯著降低黃曲霉素檢測成本。