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        鵝糞便中特基拉芽孢桿菌和類腸膜魏斯氏菌的分離鑒定

        2022-07-27 06:47:54王秋菊李暢洋陶燕子
        中國畜牧獸醫(yī) 2022年7期
        關鍵詞:基拉膽鹽抗菌藥

        魏 笑,王秋菊,孫 愉,張 昊,李暢洋,陶燕子

        (黑龍江八一農墾大學動物科技學院,大慶 163319)

        微生物制劑具有維持腸道菌群平衡,分泌益生物質提高動物免疫力,改善食物消化和吸收,誘導免疫反應等優(yōu)點,為抗菌藥替代物的研發(fā)提供了依據(jù)和保障,逐漸被人們接受并廣泛應用在養(yǎng)殖業(yè)上,以達到預防疾病、促進畜牧業(yè)健康發(fā)展的目的,因此需要進一步了解其最佳的生長環(huán)境及主要的功能。特基拉芽孢桿菌是一種產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿菌,嚴格好氧。芽孢桿菌屬產(chǎn)生的芽孢對植物病原體具有抑制能力,研究表明特基拉芽孢桿菌抑菌譜廣,具有較高的生防能力,是天然的抗菌活性物質[1],尤其對植物的土傳病害——青枯病有良好的防治效果。周瑚等[2]研究發(fā)現(xiàn),特基拉芽孢桿菌有穩(wěn)定的抑菌作用,對高溫、紫外線和酸堿環(huán)境有較強抵抗性,Oberoi等[3]報道,抗菌蛋白的溫度和酸堿度穩(wěn)定性對其產(chǎn)品的研發(fā)應用起關鍵作用,可用特基拉芽孢桿菌制成農藥。孫龍龍[4]研究發(fā)現(xiàn),特基拉芽孢桿菌可以提高鯽的消化能力、抗氧化能力和免疫力,并增加鯽腸道菌群中有益菌的豐度,降低有害菌的豐度。因此特基拉芽孢桿菌具有較強的抗菌、助消化及改善腸道菌群豐度的功能,可以進一步作為功能菌開發(fā)利用。魏斯氏菌是一種存在于發(fā)酵產(chǎn)品中的革蘭氏陽性乳酸菌,不運動不產(chǎn)生孢子,兼性厭氧,呈不規(guī)則的短桿狀。研究表明,類腸膜魏斯氏菌產(chǎn)酸能力高,對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有良好的抑制作用[5]。劉韶娜[6]研究表明,類腸膜魏斯氏菌能夠降低豬糞便中的粗蛋白和銨態(tài)氮,降低豬的腹瀉率和便秘率,能夠提高腸道內的脂肪酸含量并促進脂類代謝和維生素合成。由此可見類腸膜魏斯氏菌可作為豬飼料添加劑應用,但在禽上的應用還鮮見報道。本試驗擬從鵝腸道中分離芽孢桿菌屬和乳桿菌屬細菌,檢測其最佳生長時間、pH和溫度及其對酸堿度、膽鹽和抗菌藥的耐受性,旨在為后續(xù)作為功能菌開發(fā)提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 樣品 選取黑龍江省某畜牧場50周齡左右健康的體重為(6.7±1.2)kg的大群散養(yǎng)北方白鵝種鵝30只,在采食30 min后,取糞盒懸掛于鵝的泄殖腔外收集新鮮直腸糞便。將收集的糞便放入裝有冰袋的保溫盒中帶回實驗室。

        1.1.2 主要試劑 甘露醇卵黃多黏菌素培養(yǎng)基(HB0248)、MRS培養(yǎng)基(HB0109)、LB肉湯培養(yǎng)基(HB0128)、Mueller-Hinton瓊脂(HB6232)均購自青島海博生物科技有限公司;醋酸鉛培養(yǎng)基(L8490)購自北京索萊寶科技有限公司;羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基購自山東拓普生物工程有限公司??咕帒c大霉素、卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素、頭孢呋辛、頭孢唑啉、頭孢噻肟、氨芐西林、克拉霉素、紅霉素、復方新諾明、呋喃妥因、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、萬古霉素均購自杭州濱河微生物試劑有限公司。

        1.1.3 培養(yǎng)基配制 ①硝酸鹽還原培養(yǎng)基:100 mL蒸餾水中加入1.00 g琥珀酸鈉、0.10 g硝酸鈉、0.10 g磷酸二氫鉀、0.05 g七水硝酸鎂、0.02 g氯化鉀。②淀粉培養(yǎng)基:100 mL蒸餾水中加入2.00 g可溶性淀粉、0.50 g蛋白胨、0.50 g氯化鈉、2.00 g瓊脂,pH 7.0。③酪素培養(yǎng)基:100 mL蒸餾水中加入1.00 g干酪素、0.10 g酵母膏、2.00 g瓊脂。④酸性汞指示劑:100 mL蒸餾水中加入15.00 g氯化汞、20 mL濃鹽酸。配制后,121 ℃高壓滅菌15 min后倒入培養(yǎng)皿中待用。

        1.2 方法

        1.2.1 細菌的分離 按1 g/只分別稱取30只鵝的糞便,各加入9 mL生理鹽水振蕩混勻,取100 μL混合液加900 μL生理鹽水進行倍比稀釋,取稀釋到10-6、10-7、10-8的菌液各100 μL加入到已配好的MRS固體培養(yǎng)基中,用涂布棒涂抹均勻,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用接種環(huán)挑取單一菌落重新劃線培養(yǎng),重復3~4次。

        1.2.2 細菌篩選及生化鑒定 通特異性培養(yǎng)基和革蘭氏染色對所得菌株進行形態(tài)上的初步篩選,保留形態(tài)明顯的菌株。將初篩的細菌純化后分別接種至LB肉湯中培養(yǎng),再通過硝酸鹽還原、產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)硫化氫、產(chǎn)纖維素酶、產(chǎn)蛋白酶和接觸酶試驗等生化反應進一步篩選。

        1.2.3 16S rDNA鑒定 采用煮沸法提取細菌DNA。利用細菌16S rDNA基因通用引物343F:5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′和798R:5′-AGGG-TATCTAATCCT-3′[7]進行PCR擴增。PCR反應體系25 μL:2×PremixTaq12.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA 2 μL,ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,64 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個循環(huán);72 ℃終延伸10 min;4 ℃保存。將得到的PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳,檢測DNA的大小及濃度,并PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行16S rDNA測序。最后獲得的DNA部分序列與GenBank中參考菌株特基拉牙孢桿菌(Bacillustequilensis)、枯草牙孢桿菌(Bacillussubtitis)等序列進行比對,用Mega 11.0構建進化樹,用MegAlign進行相似性比對。

        1.2.4 生長曲線繪制 取100 μL篩選出的分離菌菌液按2.0%接種量分別接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中,以未接種細菌的LB液體培養(yǎng)基為對照,37 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng),分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48 h時取培養(yǎng)液測量D600 nm值,以時間為橫坐標、D600 nm值為縱坐標繪制生長曲線。

        1.2.5 細菌培養(yǎng)基酸堿度測定 用HCl和NaOH將LB液體培養(yǎng)基pH調至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,取100 μL篩選出的分離菌菌液按2.0%接種量接種,以未接種菌液的LB液體培養(yǎng)基為空白對照,37 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)24 h,測量D600 nm值。

        1.2.6 細菌適宜培養(yǎng)溫度測定 取100 μL篩選出的分離菌菌液分別接種到5 mL LB液體培養(yǎng)中,分別將溫度調至36.0、36.5、37.0、37.5和38 ℃,以未接種菌液的LB培養(yǎng)基作為空白對照,培養(yǎng)24 h后測量D600 nm值。

        1.2.7 酸性和高膽鹽濃度環(huán)境下細菌存活率測定 取篩選出的分離菌菌液接至pH=7.0的LB液體培養(yǎng)基中作為耐酸試驗的空白對照,將菌液接至無膽鹽的LB液體培養(yǎng)基中為耐膽鹽試驗的空白對照,分別將菌液接至pH為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0及膽鹽濃度為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%的培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)24 h,測定D600 nm值。酸性環(huán)境下細菌存活率(%)=各pH組D600 nm值/未經(jīng)酸處理組D600 nm值×100%;高膽鹽濃度環(huán)境下細菌存活率(%)=各膽鹽濃度組D600 nm值/無膽鹽組D600 nm值×100%。

        1.2.8 抗菌藥耐受性測定 取100 μL篩選出的分離菌菌液,活菌數(shù)>1×109CFU/mL,分別涂布到MH培養(yǎng)基中,用涂布棒涂抹均勻,放置抗菌藥藥片,輕輕壓實,置恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h,并用直尺測量抑菌圈直徑,以美國SCLA抗微生物敏感性試驗執(zhí)行標準M100做比較以判定菌株藥物敏感性(表1)。

        表1 藥物敏感性判斷標準

        2 結 果

        2.1 細菌的分離及生化鑒定

        利用MRS培養(yǎng)基分離乳酸菌,在培養(yǎng)基上形成表面光滑的乳白色菌落,革蘭氏染色呈長桿狀、產(chǎn)芽孢的菌體,為革蘭氏陽性菌(圖1A);芽孢桿菌使甘露醇卵黃多黏菌素培養(yǎng)基變色,在表面形成不透明的白色菌落,革蘭氏染色呈短桿狀、單個或鏈狀排列的菌體,為革蘭氏陽性菌(圖1B)。從30只鵝中共獲得9株菌,3株為乳酸菌(編號1~3),6株為芽孢桿菌(編號4~9)。由表2生化試驗結果可知,乳酸菌中2號產(chǎn)淀粉酶和纖維素酶,芽孢桿菌中7號產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶,屬于產(chǎn)酶較多的菌株,因此選擇這2株進行后續(xù)試驗,并分別編號為2020V1和2020V2。

        A,乳酸菌;B,牙孢桿菌

        表2 細菌生化試驗結果

        2.2 細菌種屬的鑒定

        由圖2可知,1.0%瓊脂糖凝膠電泳結果表明2株細菌DNA大小均在1 600 bp左右。由圖3、4可知,2020V1菌株和NCBI庫中序列編號KU601351.1的細菌進化距離為100,相似性為99.9%;2020V2菌株和NCBI庫中序列編號MT975238.1的細菌進化距離為100,相似性為99.9%,因此確定2020V1為特基拉芽孢桿菌CC2FG2,2020V2為類腸膜魏斯氏菌JY0R2。

        1~4,2020V1;5~9,2020V2;M,DL2000 DNA Marker

        圖3 2020V1(A)和2020V2(B)菌株基于16S rDNA基因的進化樹

        圖4 2020V1(A)和2020V2(B)菌株相似性比對

        2.3 細菌生長曲線

        由圖5可知,2020V1菌株的菌液濃度從4 h開始迅速增加,到16 h時到達對數(shù)生長期頂峰,隨后進入穩(wěn)定期,濃度變化不大;2020V2菌株在培養(yǎng)4 h后菌液濃度大幅增加進入對數(shù)生長期,18 h時進入生長穩(wěn)定期濃度不再發(fā)生較大波動。因此后續(xù)試驗中為獲得最高活菌數(shù),2020V1菌株至少培養(yǎng)16 h,2020V2菌株至少培養(yǎng)18 h。

        圖5 2020V1和2020V2菌株生長曲線

        2.4 細菌培養(yǎng)基酸堿度測定

        由圖6知,2020V1菌株在pH為6.5的環(huán)境下生長較好,2020V12菌株在pH為6.0的偏酸性環(huán)境下生長狀況良好。

        圖6 不同pH下2020V1和2020V2菌株的濃度

        2.5 細菌適宜培養(yǎng)溫度測定

        由圖7可知,2020V1菌株在環(huán)境溫度為36 ℃時D600 nm值最高,且隨著溫度升高D600 nm值逐漸降低;2020V2菌株在36.5 ℃時D600 nm值最高,36.5 ℃前后隨著溫度的降低或升高,D600 nm值均降低。

        圖7 不同溫度下2020V1和2020V2菌株的濃度

        2.6 酸性和高膽鹽濃度環(huán)境下細菌存活率測定

        2020V1和2020V2菌株在酸性和高膽鹽濃度濃度環(huán)境下的存活率如表3和4所示。由表3可知,在pH=3.5環(huán)境下2株菌均能生長繁殖,且存活率超過半數(shù),說明2株菌都具有耐酸能力。由表4可知,2020V1菌株能在1.5%膽鹽濃度環(huán)境下生長繁殖,且存活率超過半數(shù),2020V2菌株在1.2%膽鹽濃度環(huán)境下存活超過半數(shù),說明2株菌均具有較好的耐膽鹽能力,且2020V1菌株的耐受力高于2020V2菌株。

        表3 不同pH環(huán)境下2020V1和2020V2菌株的存活率

        表4 不同膽鹽濃度下2020V1和2020V2菌株的存活率

        2.7 抗菌藥耐受性的測定

        由表5可知,20202V1菌株對頭孢呋辛、頭孢唑林、頭孢噻肟、氨芐西林、呋喃妥因、環(huán)丙沙星、慶大霉素和四環(huán)素不敏感;對氧氟沙星、諾氟沙星、卡那霉素、鏈霉素、克拉霉素、紅霉素、復方新諾明和萬古霉素敏感。2020V2菌株對頭孢呋辛、頭孢唑林、頭孢噻肟、氨芐西林、復方新諾明、萬古霉素、慶大霉素和鏈霉素不敏感;對呋喃妥因、四環(huán)素、卡那霉素中度敏感;對氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、克拉霉素和紅霉素敏感。

        表5 2020V1和2020V2菌株藥物敏感試驗結果

        3 討 論

        特基拉芽孢桿菌和類腸膜魏斯氏菌均屬于畜牧生產(chǎn)益生菌[8-9],也是組成畜禽腸道微生物群落重要的成員。Pradhan等[10]研究發(fā)現(xiàn),特基拉芽孢桿菌可通過產(chǎn)生脂肽及生物表面活性劑等物質破壞病原菌的生物膜,從而起到抑菌作用。特基拉芽孢桿菌可提高血清溶菌酶、脂肪酶和肝臟谷丙轉氨酶的活性,從而達到促進消化、提高免疫的作用[11]。在自然界中類腸膜魏斯氏菌是一類廣泛分布于肉類、新鮮果蔬、發(fā)酵食物、青貯飼料中的乳酸菌[12],其可廣泛定植于宿主腸道[13-14]。研究發(fā)現(xiàn),魏斯氏菌應用于食品發(fā)酵時,可合成葡聚糖和果聚糖等低聚糖,這些低聚糖可促進人體對微量元素的吸收,減輕人體腸胃不適,促進雙歧桿菌增殖[15]。本試驗中,2020V1菌株屬于芽孢桿菌屬中的特基拉芽孢桿菌,2020V2菌株屬于乳酸菌屬中的類腸膜魏斯氏菌,2株菌均具有較強的耐酸耐膽鹽能力,能夠在腸道中定植并發(fā)揮作用,并能與部分抗菌藥聯(lián)合用藥。

        2020V1和2020V2菌株作為微生物制劑的潛在益生菌,需測定其生長特性和耐酸耐膽鹽能力以確定能否經(jīng)過口腔進入消化道,通過胃液和膽汁最終定植并發(fā)在腸道發(fā)揮作用。2020V1和2020V2菌株在pH為3.5環(huán)境下存活率分別為81.5%和87.6%,在膽堿濃度為1.2%環(huán)境下存活率分別為69.2%和50.6%,均超過pH=7和無膽鹽組半數(shù),證明2種微生物可以通過胃酸和膽汁且活菌數(shù)仍然保持在正常范圍,說明其能夠順利定植在腸道發(fā)揮作用,這與樊炳君等[16]和李文等[17]試驗結果相符。2020V1菌株的生長特性研究結果表明,在4 h達到對數(shù)生長期,在36 ℃、pH為6.5的環(huán)境下培養(yǎng)較好,這與王旭[18]的生長特性研究一致。2020V2菌株的生長特性結果表明,在4 h達到對數(shù)生長期,在36.5 ℃、pH為6的環(huán)境下進行培養(yǎng)最為適宜,與高靜等[19]研究結果相符合。

        為確定2020V1和2020V2菌株對抗菌藥的耐受性,采用美國SCLA抗微生物敏感性試驗執(zhí)行標準M100作為耐藥、敏感和中介值進行判定。選擇與抗菌藥同時使用時,注意選擇那些可相容的抗菌藥,試驗結果顯示,2020V1菌株能耐受部分β-內酰胺類、硝基呋喃類、喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類抗菌藥,與郭佳等[20]研究的芽孢桿菌菌抗菌藥耐受部分結果一致,部分結果不同可能是因為菌種雖然同屬但不同種,微生物自身攜帶的耐藥基因不同所導致,這需要后續(xù)試驗來證明;2020V2菌株能耐受部分β-內酰胺類、磺胺類、糖肽類、氨基糖苷類抗菌藥,這與部分乳酸菌對抗菌藥耐受性結果一致。在本研究中,通過分離得到2020V1和2020V2 2株益生菌,其對抗菌藥具有不同程度的耐受性,可為將來在動物治療過程中抗菌藥的選用提供理論依據(jù)。

        4 結 論

        本研究成功從健康成年北方白鵝直腸糞便中分離到9株細菌,生化試驗鑒定為特基拉芽孢桿菌CC2FG2和類腸膜魏斯氏菌JY0R2,2種菌均具有耐酸、耐膽鹽的特性。特基拉芽孢桿菌CC2FG2能與β-內酰胺類、喹諾酮類和四環(huán)素類四環(huán)素聯(lián)合使用;類腸膜魏斯氏菌JY0R2能與β-內酰胺類、磺胺類、糖肽類、氨基糖苷類聯(lián)合使用。該結果可為鵝源功能菌的研發(fā)及其對抗菌藥的選用提供思路。

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