魏 笑，王秋菊，孫 愉，張 昊，李暢洋，陶燕子

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319)

微生物制劑具有維持腸道菌群平衡，分泌益生物質(zhì)提高動(dòng)物免疫力，改善食物消化和吸收，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，為抗菌藥替代物的研發(fā)提供了依據(jù)和保障，逐漸被人們接受并廣泛應(yīng)用在養(yǎng)殖業(yè)上，以達(dá)到預(yù)防疾病、促進(jìn)畜牧業(yè)健康發(fā)展的目的，因此需要進(jìn)一步了解其最佳的生長環(huán)境及主要的功能。特基拉芽孢桿菌是一種產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿菌，嚴(yán)格好氧。芽孢桿菌屬產(chǎn)生的芽孢對(duì)植物病原體具有抑制能力，研究表明特基拉芽孢桿菌抑菌譜廣，具有較高的生防能力，是天然的抗菌活性物質(zhì)[1]，尤其對(duì)植物的土傳病害——青枯病有良好的防治效果。周瑚等[2]研究發(fā)現(xiàn)，特基拉芽孢桿菌有穩(wěn)定的抑菌作用，對(duì)高溫、紫外線和酸堿環(huán)境有較強(qiáng)抵抗性，Oberoi等[3]報(bào)道，抗菌蛋白的溫度和酸堿度穩(wěn)定性對(duì)其產(chǎn)品的研發(fā)應(yīng)用起關(guān)鍵作用，可用特基拉芽孢桿菌制成農(nóng)藥。孫龍龍[4]研究發(fā)現(xiàn)，特基拉芽孢桿菌可以提高鯽的消化能力、抗氧化能力和免疫力，并增加鯽腸道菌群中有益菌的豐度，降低有害菌的豐度。因此特基拉芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抗菌、助消化及改善腸道菌群豐度的功能，可以進(jìn)一步作為功能菌開發(fā)利用。魏斯氏菌是一種存在于發(fā)酵產(chǎn)品中的革蘭氏陽性乳酸菌，不運(yùn)動(dòng)不產(chǎn)生孢子，兼性厭氧，呈不規(guī)則的短桿狀。研究表明，類腸膜魏斯氏菌產(chǎn)酸能力高，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有良好的抑制作用[5]。劉韶娜[6]研究表明，類腸膜魏斯氏菌能夠降低豬糞便中的粗蛋白和銨態(tài)氮，降低豬的腹瀉率和便秘率，能夠提高腸道內(nèi)的脂肪酸含量并促進(jìn)脂類代謝和維生素合成。由此可見類腸膜魏斯氏菌可作為豬飼料添加劑應(yīng)用，但在禽上的應(yīng)用還鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)擬從鵝腸道中分離芽孢桿菌屬和乳桿菌屬細(xì)菌，檢測(cè)其最佳生長時(shí)間、pH和溫度及其對(duì)酸堿度、膽鹽和抗菌藥的耐受性，旨在為后續(xù)作為功能菌開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 選取黑龍江省某畜牧場(chǎng)50周齡左右健康的體重為(6.7±1.2)kg的大群散養(yǎng)北方白鵝種鵝30只，在采食30 min后，取糞盒懸掛于鵝的泄殖腔外收集新鮮直腸糞便。將收集的糞便放入裝有冰袋的保溫盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑 甘露醇卵黃多黏菌素培養(yǎng)基(HB0248)、MRS培養(yǎng)基(HB0109)、LB肉湯培養(yǎng)基(HB0128)、Mueller-Hinton瓊脂(HB6232)均購自青島海博生物科技有限公司；醋酸鉛培養(yǎng)基(L8490)購自北京索萊寶科技有限公司；羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基購自山東拓普生物工程有限公司?？咕帒c大霉素、卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素、頭孢呋辛、頭孢唑啉、頭孢噻肟、氨芐西林、克拉霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、呋喃妥因、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、萬古霉素均購自杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基配制 ①硝酸鹽還原培養(yǎng)基：100 mL蒸餾水中加入1.00 g琥珀酸鈉、0.10 g硝酸鈉、0.10 g磷酸二氫鉀、0.05 g七水硝酸鎂、0.02 g氯化鉀。②淀粉培養(yǎng)基：100 mL蒸餾水中加入2.00 g可溶性淀粉、0.50 g蛋白胨、0.50 g氯化鈉、2.00 g瓊脂，pH 7.0。③酪素培養(yǎng)基：100 mL蒸餾水中加入1.00 g干酪素、0.10 g酵母膏、2.00 g瓊脂。④酸性汞指示劑：100 mL蒸餾水中加入15.00 g氯化汞、20 mL濃鹽酸。配制后，121 ℃高壓滅菌15 min后倒入培養(yǎng)皿中待用。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離 按1 g/只分別稱取30只鵝的糞便，各加入9 mL生理鹽水振蕩混勻，取100 μL混合液加900 μL生理鹽水進(jìn)行倍比稀釋，取稀釋到10-6、10-7、10-8的菌液各100 μL加入到已配好的MRS固體培養(yǎng)基中，用涂布棒涂抹均勻，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用接種環(huán)挑取單一菌落重新劃線培養(yǎng)，重復(fù)3～4次。

1.2.2 細(xì)菌篩選及生化鑒定 通特異性培養(yǎng)基和革蘭氏染色對(duì)所得菌株進(jìn)行形態(tài)上的初步篩選，保留形態(tài)明顯的菌株。將初篩的細(xì)菌純化后分別接種至LB肉湯中培養(yǎng)，再通過硝酸鹽還原、產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)硫化氫、產(chǎn)纖維素酶、產(chǎn)蛋白酶和接觸酶試驗(yàn)等生化反應(yīng)進(jìn)一步篩選。

1.2.3 16S rDNA鑒定 采用煮沸法提取細(xì)菌DNA。利用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物343F：5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′和798R：5′-AGGG-TATCTAATCCT-3′[7]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×PremixTaq12.5 μL,上、下游引物各1 μL，DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)DNA的大小及濃度，并PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。最后獲得的DNA部分序列與GenBank中參考菌株特基拉牙孢桿菌(Bacillustequilensis)、枯草牙孢桿菌(Bacillussubtitis)等序列進(jìn)行比對(duì)，用Mega 11.0構(gòu)建進(jìn)化樹，用MegAlign進(jìn)行相似性比對(duì)。

1.2.4 生長曲線繪制 取100 μL篩選出的分離菌菌液按2.0%接種量分別接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，以未接種細(xì)菌的LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，37 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)，分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48 h時(shí)取培養(yǎng)液測(cè)量D600 nm值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、D600 nm值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.2.5 細(xì)菌培養(yǎng)基酸堿度測(cè)定 用HCl和NaOH將LB液體培養(yǎng)基pH調(diào)至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，取100 μL篩選出的分離菌菌液按2.0%接種量接種，以未接種菌液的LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，37 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，測(cè)量D600 nm值。

1.2.6 細(xì)菌適宜培養(yǎng)溫度測(cè)定 取100 μL篩選出的分離菌菌液分別接種到5 mL LB液體培養(yǎng)中，分別將溫度調(diào)至36.0、36.5、37.0、37.5和38 ℃，以未接種菌液的LB培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，培養(yǎng)24 h后測(cè)量D600 nm值。

1.2.7 酸性和高膽鹽濃度環(huán)境下細(xì)菌存活率測(cè)定 取篩選出的分離菌菌液接至pH=7.0的LB液體培養(yǎng)基中作為耐酸試驗(yàn)的空白對(duì)照，將菌液接至無膽鹽的LB液體培養(yǎng)基中為耐膽鹽試驗(yàn)的空白對(duì)照，分別將菌液接至pH為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0及膽鹽濃度為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%的培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，測(cè)定D600 nm值。酸性環(huán)境下細(xì)菌存活率(%)=各pH組D600 nm值/未經(jīng)酸處理組D600 nm值×100%；高膽鹽濃度環(huán)境下細(xì)菌存活率(%)=各膽鹽濃度組D600 nm值/無膽鹽組D600 nm值×100%。

1.2.8 抗菌藥耐受性測(cè)定 取100 μL篩選出的分離菌菌液，活菌數(shù)>1×109CFU/mL，分別涂布到MH培養(yǎng)基中，用涂布棒涂抹均勻，放置抗菌藥藥片，輕輕壓實(shí)，置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，并用直尺測(cè)量抑菌圈直徑，以美國SCLA抗微生物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)M100做比較以判定菌株藥物敏感性(表1)。

表1 藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌的分離及生化鑒定

利用MRS培養(yǎng)基分離乳酸菌，在培養(yǎng)基上形成表面光滑的乳白色菌落，革蘭氏染色呈長桿狀、產(chǎn)芽孢的菌體，為革蘭氏陽性菌(圖1A)；芽孢桿菌使甘露醇卵黃多黏菌素培養(yǎng)基變色，在表面形成不透明的白色菌落，革蘭氏染色呈短桿狀、單個(gè)或鏈狀排列的菌體，為革蘭氏陽性菌(圖1B)。從30只鵝中共獲得9株菌，3株為乳酸菌(編號(hào)1～3)，6株為芽孢桿菌(編號(hào)4～9)。由表2生化試驗(yàn)結(jié)果可知，乳酸菌中2號(hào)產(chǎn)淀粉酶和纖維素酶，芽孢桿菌中7號(hào)產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶，屬于產(chǎn)酶較多的菌株，因此選擇這2株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，并分別編號(hào)為2020V1和2020V2。

A,乳酸菌；B,牙孢桿菌

表2 細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果

2.2 細(xì)菌種屬的鑒定

由圖2可知，1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明2株細(xì)菌DNA大小均在1 600 bp左右。由圖3、4可知，2020V1菌株和NCBI庫中序列編號(hào)KU601351.1的細(xì)菌進(jìn)化距離為100，相似性為99.9%；2020V2菌株和NCBI庫中序列編號(hào)MT975238.1的細(xì)菌進(jìn)化距離為100，相似性為99.9%，因此確定2020V1為特基拉芽孢桿菌CC2FG2，2020V2為類腸膜魏斯氏菌JY0R2。

1～4，2020V1；5～9，2020V2；M，DL2000 DNA Marker

圖3 2020V1(A)和2020V2(B)菌株基于16S rDNA基因的進(jìn)化樹

圖4 2020V1(A)和2020V2(B)菌株相似性比對(duì)

2.3 細(xì)菌生長曲線

由圖5可知，2020V1菌株的菌液濃度從4 h開始迅速增加，到16 h時(shí)到達(dá)對(duì)數(shù)生長期頂峰，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期，濃度變化不大；2020V2菌株在培養(yǎng)4 h后菌液濃度大幅增加進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，18 h時(shí)進(jìn)入生長穩(wěn)定期濃度不再發(fā)生較大波動(dòng)。因此后續(xù)試驗(yàn)中為獲得最高活菌數(shù)，2020V1菌株至少培養(yǎng)16 h，2020V2菌株至少培養(yǎng)18 h。

圖5 2020V1和2020V2菌株生長曲線

2.4 細(xì)菌培養(yǎng)基酸堿度測(cè)定

由圖6知，2020V1菌株在pH為6.5的環(huán)境下生長較好，2020V12菌株在pH為6.0的偏酸性環(huán)境下生長狀況良好。

圖6 不同pH下2020V1和2020V2菌株的濃度

2.5 細(xì)菌適宜培養(yǎng)溫度測(cè)定

由圖7可知，2020V1菌株在環(huán)境溫度為36 ℃時(shí)D600 nm值最高，且隨著溫度升高D600 nm值逐漸降低；2020V2菌株在36.5 ℃時(shí)D600 nm值最高，36.5 ℃前后隨著溫度的降低或升高，D600 nm值均降低。

圖7 不同溫度下2020V1和2020V2菌株的濃度

2.6 酸性和高膽鹽濃度環(huán)境下細(xì)菌存活率測(cè)定

2020V1和2020V2菌株在酸性和高膽鹽濃度濃度環(huán)境下的存活率如表3和4所示。由表3可知，在pH=3.5環(huán)境下2株菌均能生長繁殖，且存活率超過半數(shù)，說明2株菌都具有耐酸能力。由表4可知，2020V1菌株能在1.5%膽鹽濃度環(huán)境下生長繁殖，且存活率超過半數(shù)，2020V2菌株在1.2%膽鹽濃度環(huán)境下存活超過半數(shù)，說明2株菌均具有較好的耐膽鹽能力，且2020V1菌株的耐受力高于2020V2菌株。

表3 不同pH環(huán)境下2020V1和2020V2菌株的存活率

表4 不同膽鹽濃度下2020V1和2020V2菌株的存活率

2.7 抗菌藥耐受性的測(cè)定

由表5可知，20202V1菌株對(duì)頭孢呋辛、頭孢唑林、頭孢噻肟、氨芐西林、呋喃妥因、環(huán)丙沙星、慶大霉素和四環(huán)素不敏感；對(duì)氧氟沙星、諾氟沙星、卡那霉素、鏈霉素、克拉霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明和萬古霉素敏感。2020V2菌株對(duì)頭孢呋辛、頭孢唑林、頭孢噻肟、氨芐西林、復(fù)方新諾明、萬古霉素、慶大霉素和鏈霉素不敏感；對(duì)呋喃妥因、四環(huán)素、卡那霉素中度敏感；對(duì)氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、克拉霉素和紅霉素敏感。

表5 2020V1和2020V2菌株藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

特基拉芽孢桿菌和類腸膜魏斯氏菌均屬于畜牧生產(chǎn)益生菌[8-9]，也是組成畜禽腸道微生物群落重要的成員。Pradhan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，特基拉芽孢桿菌可通過產(chǎn)生脂肽及生物表面活性劑等物質(zhì)破壞病原菌的生物膜，從而起到抑菌作用。特基拉芽孢桿菌可提高血清溶菌酶、脂肪酶和肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性，從而達(dá)到促進(jìn)消化、提高免疫的作用[11]。在自然界中類腸膜魏斯氏菌是一類廣泛分布于肉類、新鮮果蔬、發(fā)酵食物、青貯飼料中的乳酸菌[12]，其可廣泛定植于宿主腸道[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，魏斯氏菌應(yīng)用于食品發(fā)酵時(shí)，可合成葡聚糖和果聚糖等低聚糖，這些低聚糖可促進(jìn)人體對(duì)微量元素的吸收，減輕人體腸胃不適，促進(jìn)雙歧桿菌增殖[15]。本試驗(yàn)中，2020V1菌株屬于芽孢桿菌屬中的特基拉芽孢桿菌，2020V2菌株屬于乳酸菌屬中的類腸膜魏斯氏菌，2株菌均具有較強(qiáng)的耐酸耐膽鹽能力，能夠在腸道中定植并發(fā)揮作用，并能與部分抗菌藥聯(lián)合用藥。

2020V1和2020V2菌株作為微生物制劑的潛在益生菌，需測(cè)定其生長特性和耐酸耐膽鹽能力以確定能否經(jīng)過口腔進(jìn)入消化道，通過胃液和膽汁最終定植并發(fā)在腸道發(fā)揮作用。2020V1和2020V2菌株在pH為3.5環(huán)境下存活率分別為81.5%和87.6%，在膽堿濃度為1.2%環(huán)境下存活率分別為69.2%和50.6%，均超過pH=7和無膽鹽組半數(shù)，證明2種微生物可以通過胃酸和膽汁且活菌數(shù)仍然保持在正常范圍，說明其能夠順利定植在腸道發(fā)揮作用，這與樊炳君等[16]和李文等[17]試驗(yàn)結(jié)果相符。2020V1菌株的生長特性研究結(jié)果表明，在4 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長期，在36 ℃、pH為6.5的環(huán)境下培養(yǎng)較好，這與王旭[18]的生長特性研究一致。2020V2菌株的生長特性結(jié)果表明，在4 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長期，在36.5 ℃、pH為6的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)最為適宜，與高靜等[19]研究結(jié)果相符合。

為確定2020V1和2020V2菌株對(duì)抗菌藥的耐受性，采用美國SCLA抗微生物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)M100作為耐藥、敏感和中介值進(jìn)行判定。選擇與抗菌藥同時(shí)使用時(shí)，注意選擇那些可相容的抗菌藥，試驗(yàn)結(jié)果顯示，2020V1菌株能耐受部分β-內(nèi)酰胺類、硝基呋喃類、喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類抗菌藥，與郭佳等[20]研究的芽孢桿菌菌抗菌藥耐受部分結(jié)果一致，部分結(jié)果不同可能是因?yàn)榫N雖然同屬但不同種，微生物自身攜帶的耐藥基因不同所導(dǎo)致，這需要后續(xù)試驗(yàn)來證明；2020V2菌株能耐受部分β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、糖肽類、氨基糖苷類抗菌藥，這與部分乳酸菌對(duì)抗菌藥耐受性結(jié)果一致。在本研究中，通過分離得到2020V1和2020V2 2株益生菌，其對(duì)抗菌藥具有不同程度的耐受性，可為將來在動(dòng)物治療過程中抗菌藥的選用提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究成功從健康成年北方白鵝直腸糞便中分離到9株細(xì)菌，生化試驗(yàn)鑒定為特基拉芽孢桿菌CC2FG2和類腸膜魏斯氏菌JY0R2，2種菌均具有耐酸、耐膽鹽的特性。特基拉芽孢桿菌CC2FG2能與β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類和四環(huán)素類四環(huán)素聯(lián)合使用；類腸膜魏斯氏菌JY0R2能與β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、糖肽類、氨基糖苷類聯(lián)合使用。該結(jié)果可為鵝源功能菌的研發(fā)及其對(duì)抗菌藥的選用提供思路。