楊鈺瑩，王少林

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642)

腸球菌作為一種環(huán)境適應(yīng)性極強(qiáng)的革蘭陽(yáng)性球菌，在自然界中分布廣泛，被稱作耐藥基因的“存儲(chǔ)池”，是人類和獸醫(yī)耐藥性監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的重要指示菌[1-2]。養(yǎng)殖業(yè)中飼用抗菌促生長(zhǎng)劑的廣泛應(yīng)用是腸球菌產(chǎn)生獲得性耐藥的重要驅(qū)動(dòng)力，并進(jìn)一步造成了耐藥菌及耐藥基因向食物鏈傳播，威脅公共衛(wèi)生安全[3]。建立動(dòng)物源腸球菌對(duì)飼用抗菌促生長(zhǎng)劑的耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)2020年中國(guó)全面“禁抗”后腸球耐藥表型變化的監(jiān)測(cè)具有重要意義。

1986年，由于在動(dòng)物糞便中檢測(cè)到了與人源分離株高度相似的耐萬(wàn)古霉素腸球菌(VRE)，瑞典、丹麥和瑞士禁止將阿伐他汀作為動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加使用。1999年，桿菌肽、維吉尼亞霉素和泰樂(lè)菌素等在歐洲被列入促生長(zhǎng)劑禁用名單。至2006年，歐盟禁用了所有的抗菌促生長(zhǎng)劑。此項(xiàng)禁令后，VRE等腸球耐藥菌在動(dòng)物、食品和人群的檢出率顯著下降。然而，多年后依然能在動(dòng)物和人類的糞便中檢測(cè)到VRE，說(shuō)明飼用促生長(zhǎng)劑對(duì)于腸球菌耐藥性發(fā)展具有持久的影響[4]。自20世紀(jì)70年代中期，中國(guó)逐漸開(kāi)始將抗菌藥作為動(dòng)物促生長(zhǎng)劑使用[5]。2001年中國(guó)農(nóng)業(yè)部168號(hào)公告允許吉他霉素、黃霉素、恩拉霉素、那西肽、維吉尼亞霉素、桿菌肽等作為抗菌藥物飼料添加劑在飼料中長(zhǎng)期添加使用[6]。此后抗菌促生長(zhǎng)劑的廣泛使用尤其是不合理應(yīng)用加重了細(xì)菌耐藥性發(fā)展、耐藥基因出現(xiàn)、生態(tài)環(huán)境污染，以及食品安全問(wèn)題等[7]。2019年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部194號(hào)公告規(guī)定藥物促生長(zhǎng)添加劑(中藥類除外)在2020年全部退出畜牧養(yǎng)殖業(yè)以遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥風(fēng)險(xiǎn)[8]。而目前國(guó)內(nèi)仍缺乏針對(duì)動(dòng)物源腸球菌對(duì)飼用抗菌促生長(zhǎng)劑耐藥性的判定標(biāo)準(zhǔn)。

流行病學(xué)臨界值(epidemiological cut-off values,ECOFFs)，又稱野生型折點(diǎn)(wild-type cutoff,COWT)，指用于區(qū)分野生型菌株和非野生型菌株的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)值。流行病學(xué)臨界值的確立是耐藥折點(diǎn)制定的第一步，需大量的MIC數(shù)據(jù)支撐，因其主要考察細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性情況，對(duì)于監(jiān)測(cè)細(xì)菌的耐藥表型具有重要意義[9]。

目前建立耐藥折點(diǎn)制定標(biāo)準(zhǔn)的組織主要有美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)與歐洲藥敏試驗(yàn)委員會(huì)(EUCAST)[10]。本研究參考CLST-VET[11]中關(guān)于獸用耐藥性判定標(biāo)準(zhǔn)的制定方法，建立了動(dòng)物源腸球菌對(duì)7種飼用抗菌促生長(zhǎng)劑的流行病學(xué)臨界值，以期填補(bǔ)國(guó)內(nèi)腸球菌對(duì)飼用抗菌促生長(zhǎng)劑流行病學(xué)臨界值的研究空白，對(duì)開(kāi)展腸球菌耐藥表型的監(jiān)測(cè)具有重要參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司)；腸球菌屬顯色培養(yǎng)基(疊氮納-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂)、檸檬酸鐵銨、腦心浸液(BHI)瓊脂(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)；革蘭陽(yáng)性需氧菌藥敏檢測(cè)板(促生長(zhǎng)藥敏檢測(cè)系列，上海星佰生物技術(shù)有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控腸球菌(Enterococcusfaecalis,ATCC 29212)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物源腸球菌的分離、鑒定與保存 2019-2021年從北京、河北、四川、山西、陜西和內(nèi)蒙古養(yǎng)殖場(chǎng)采集動(dòng)物直腸/泄殖腔拭子630份、腸道內(nèi)容物473份，接種腸球菌屬顯色培養(yǎng)基，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24～48 h。觀察菌落形態(tài)。挑取單個(gè)可疑腸球菌菌落，接種于腸球菌顯色培養(yǎng)基，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24～48 h進(jìn)一步純化。取純化菌，均勻涂布于靶板樣品孔中，晾干，加基質(zhì)溶液1 μL，混勻，晾干，待測(cè)。將樣品靶板放置于質(zhì)譜儀樣品靶板槽，采集數(shù)據(jù)并處理。將采集的樣品數(shù)據(jù)圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)菌株的數(shù)據(jù)圖譜比對(duì)，得到相似度數(shù)值，鑒定分值達(dá)種水平可信即可判斷。將質(zhì)譜鑒定為腸球菌的新鮮純化菌，加無(wú)菌生理鹽水制成菌懸液，與滅菌甘油溶液混合，使甘油終濃度為20%～40%，-80 ℃保存。

1.2.2 MIC測(cè)定 將分離保存的腸球菌進(jìn)行至少2次的復(fù)蘇轉(zhuǎn)種。傳代后，挑取菌落數(shù)個(gè)，置2～3 mL滅菌生理鹽水中，用0.5麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比濁，調(diào)制菌液濃度為1.5×108CFU/mL左右。取上述菌液60 μL，滴入無(wú)菌加樣槽中，加營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液1支(12 mL)混勻。用微量移液器吸取稀釋菌液100 μL，加入96孔微量藥敏板(H12陰性對(duì)照孔除外)。將板條放入恒溫培養(yǎng)箱中35 ℃培養(yǎng)18～20 h。自培養(yǎng)箱中取出板條，用干毛巾輕輕擦拭板條底部。肉眼判讀各個(gè)孔的陰陽(yáng)性結(jié)果，混濁為陽(yáng)性，清晰為陰性。

1.2.3 流行病學(xué)臨界值的建立 將測(cè)定的MIC數(shù)據(jù)輸入統(tǒng)計(jì)軟件ECOFFinder XL2010 v 2.0[12]中，繪制出MIC原始數(shù)據(jù)分布直方圖及原始MIC分布數(shù)據(jù)趨勢(shì)線，采用非線性回歸分析法擬合MIC累計(jì)分布，在最佳擬合范圍內(nèi)確定在不同置信區(qū)間的流行病學(xué)臨界值。取置信區(qū)間為95%的流行病學(xué)臨界值進(jìn)行耐藥率計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 MIC分布

本研究測(cè)定了2019-2021年分離自不同省市養(yǎng)殖場(chǎng)的腸球菌對(duì)7種飼用抗菌促生長(zhǎng)劑的MIC值，針對(duì)阿維拉霉素、恩拉霉素、桿菌肽、黃霉素、吉他霉素、那西肽和維吉尼亞霉素的分別為787、662、585、697、160和797株(表1)。

表1 2019-2021年分離自不同省市養(yǎng)殖場(chǎng)且測(cè)定MIC值的腸球菌

將測(cè)得的MIC數(shù)據(jù)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，由圖1可知，動(dòng)物源腸球菌對(duì)阿維拉霉素的MIC分布范圍在0.25～64 μg/mL，最多分布在2 μg/mL；對(duì)恩拉霉素的MIC分布范圍在0.5～16 μg/mL，最多分布在2 μg/mL；對(duì)桿菌肽的MIC分布范圍在2～256 μg/mL，最多分布在8 μg/mL；對(duì)黃霉素的MIC分布范圍在1～512 μg/mL，最多分布在2 μg/mL；對(duì)吉他霉素的MIC分布范圍在1～16 μg/mL，最多分布在2 μg/mL；對(duì)那西肽的MIC分布范圍在0.016～0.5 μg/mL，最多分布在0.06 μg/mL；對(duì)維吉尼亞霉素的MIC分布范圍在0.25～64 μg/mL，最多分布在8 μg/mL。其中，MIC數(shù)據(jù)分布最廣的為黃霉素，其次為維吉尼亞霉素和阿維拉霉素。

A，阿維拉霉素；B，恩拉霉素；C，桿菌肽；D，黃霉素；E，吉他霉素；F，那西肽；G，維吉尼亞霉素

2.2 流行病學(xué)臨界值的確立

對(duì)7種抗菌促生長(zhǎng)劑的MIC分布數(shù)據(jù)分別進(jìn)行非線性回歸擬合，擬合線呈對(duì)數(shù)正態(tài)分布，不同置信區(qū)間下的流行病學(xué)臨界值見(jiàn)表2。不同置信區(qū)間下得到的流行病學(xué)臨界值存在差異，在95.00%置信區(qū)間下，動(dòng)物源腸球菌對(duì)阿維拉霉素、恩拉霉素、黃霉素、吉他霉素、維吉尼亞霉素的流行病學(xué)臨界值都為8 μg/mL；對(duì)桿菌肽的流行病學(xué)臨界值為32 μg/mL；對(duì)那西肽的流行病學(xué)臨界值為0.25 μg/mL。由此制定的動(dòng)物源腸球菌對(duì)阿維拉霉素、恩拉霉素、桿菌肽、黃霉素、吉他霉素、那西肽、維吉尼亞霉素的流行病學(xué)臨界值分別為8、8、32、8、8、0.25和8 μg/mL。

表2 動(dòng)物源腸球菌對(duì)抗菌促生長(zhǎng)劑在不同置信區(qū)間下的流行病學(xué)臨界值

2.3 耐藥率

以95%置信區(qū)間下的流行病學(xué)臨界值計(jì)算動(dòng)物源腸球菌對(duì)7種抗菌促生長(zhǎng)劑的耐藥率。所有菌株對(duì)7種抗菌促生長(zhǎng)劑的耐藥率見(jiàn)表3。由表3可知，動(dòng)物源腸球菌對(duì)恩拉霉素(多肽類)的耐藥率最高，達(dá)到80.06%；其次是吉他霉素(大環(huán)內(nèi)酯類)，為64.38%；維吉尼亞霉素(鏈陽(yáng)性菌素)為50.69%；對(duì)黃霉素(多糖類)、桿菌肽(多肽類)、阿維拉霉素(寡聚糖類)和那西肽(多肽類)的耐藥率相對(duì)較低，分別為34.43%、24.96%、19.06%和14.69%，表明近年來(lái)動(dòng)物源腸球菌對(duì)恩拉霉素、吉他霉素和維吉尼亞霉素的耐藥情況相對(duì)更為嚴(yán)重。2019-2021年動(dòng)物源腸球菌對(duì)7種抗菌促生長(zhǎng)劑的耐藥率變化見(jiàn)圖2。由圖2可知，動(dòng)物源腸球菌對(duì)黃霉素的耐藥率在2019-2021年有較大幅度的下降，對(duì)桿菌肽的耐藥率有較小幅度的降低，而對(duì)于其他抗菌促生長(zhǎng)藥物的耐藥率都有不同程度的上升。

表3 95%置信區(qū)間下動(dòng)物源腸球菌對(duì)抗菌促生長(zhǎng)劑的耐藥率

圖2 95%置信區(qū)間下2019—2021年動(dòng)物源腸球菌對(duì)抗菌促生長(zhǎng)劑的耐藥率變化

3 討 論

中國(guó)作為畜禽養(yǎng)殖大國(guó)，是全球獸用化學(xué)制劑使用量最大的國(guó)家之一。獸用抗菌藥按用途一般可分為治療和促生長(zhǎng)兩大類。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)，促生長(zhǎng)作用的獸用抗菌藥用量在近年來(lái)已占到了抗菌藥總用量的近一半[13]?？咕幬镌陲暳系奶砑邮褂迷诜乐蝿?dòng)物疫病、提高養(yǎng)殖效益方面發(fā)揮了極大作用，但同時(shí)也加速了動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性的發(fā)展，威脅公共衛(wèi)生安全。本研究包括的7種抗生素屬于2001年農(nóng)業(yè)部公告批準(zhǔn)在飼料中長(zhǎng)期添加的抗菌藥物，已在畜牧養(yǎng)殖業(yè)應(yīng)用了近20年，2020年7月開(kāi)始被禁止使用。

本研究結(jié)果顯示，動(dòng)物源腸球菌對(duì)阿維拉霉素、恩拉霉素、桿菌肽、黃霉素、吉他霉素、那西肽、維吉尼亞霉素的流行病學(xué)臨界值分別為8、8、32、8、8、0.25和8 μg/mL。在這幾種藥物中，動(dòng)物源腸球菌對(duì)桿菌肽的流行病學(xué)臨界值最高，為32 μg/mL，表明目前其耐藥水平較高。桿菌肽是一種多肽類抗生素，可治療革蘭陽(yáng)性菌引起的局部感染，介導(dǎo)桿菌肽耐藥的主要為耐藥基因簇bcrRABD，目前對(duì)于bcrRABD基因簇在動(dòng)物源腸球菌中流行情況的研究仍相對(duì)缺乏[14]。已有研究表明，bcrRABD基因簇可通過(guò)腸球菌的克隆傳播，質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移及ISEnfa1形成的轉(zhuǎn)移元件在腸球菌之間擴(kuò)散[15]。動(dòng)物源腸球菌對(duì)那西肽的流行病學(xué)臨界值僅為0.25 μg/mL，表明腸球菌對(duì)那西肽非常敏感。這可能是由于那西肽是一種較為新型的飼料添加劑，由于產(chǎn)量不高的問(wèn)題在中國(guó)發(fā)展應(yīng)用的時(shí)間較晚[16]。

維吉尼霉素與新型人類抗菌藥Synercid都屬于鏈陽(yáng)性菌素，Synercid可治療VRE引起的感染，被認(rèn)為是臨床最有應(yīng)用前景的抗生素之一[17]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Synercid投入臨床使用前后均在臨床和畜禽源腸球菌中分離到了相同的抗性質(zhì)粒(satA)和抗性基因(vatD,vatE)，研究認(rèn)為維吉尼霉素對(duì)動(dòng)物的選擇壓力很可能是引起人Synercid耐藥現(xiàn)象的直接原因[18-20]。阿維拉霉素是一種寡聚糖類抗生素，目前推測(cè)能與人用抗生素Ziracin產(chǎn)生交叉耐藥性。Ziracin對(duì)各種革蘭陽(yáng)性菌的抗菌活性高于萬(wàn)古霉素及奎奴普丁-達(dá)福普汀，是一種重要的臨床藥物[21]。本研究結(jié)果顯示，動(dòng)物源腸球菌對(duì)維吉尼亞霉素的耐藥率較高，為50.69%，對(duì)阿維拉霉素的耐藥率為19.06%，這需引起警惕。

桿菌肽、阿維拉霉素和黃霉素在此前多個(gè)報(bào)道中均被發(fā)現(xiàn)對(duì)畜禽動(dòng)物腸道菌群具有較大的選擇壓力[22-23]。本研究動(dòng)物源腸球菌對(duì)黃霉素、桿菌肽和阿維拉霉素的耐藥率分別為34.43%、24.96%和19.06%，需進(jìn)一步追蹤禁用這些藥物后耐藥性及相關(guān)耐藥基因的情況。動(dòng)物源腸球菌對(duì)恩拉霉素和吉他霉素的耐藥率在本研究中表現(xiàn)最高，但其耐藥情況在國(guó)內(nèi)外均少有報(bào)道，未來(lái)需要更多的關(guān)注和研究。

在近幾年中國(guó)促生長(zhǎng)獸用抗菌藥使用統(tǒng)計(jì)中，用量占比從高到低分別為桿菌肽、吉他霉素、維吉尼亞霉素、恩拉霉素、黃霉素、那西肽、阿維拉霉素，尤其集中在前5種藥物[24-25]。本研究中，動(dòng)物源腸球菌對(duì)使用量最少的那西肽和阿維拉霉素的耐藥率也最低(19.06%和14.69%)。在2020年的促生長(zhǎng)獸用抗菌藥物統(tǒng)計(jì)中，桿菌肽的使用量比之2019年下降了50%以上，黃霉素、吉他霉素和恩拉霉素的使用量下降了80%以上[13，25]，但在2019-2021年的耐藥率變化情況統(tǒng)計(jì)中，除了黃霉素和桿菌肽，其他抗菌藥物的耐藥率依然呈上升趨勢(shì)。主要原因可能是監(jiān)測(cè)時(shí)間較短及每年監(jiān)測(cè)涉及的養(yǎng)殖場(chǎng)具有一定差異性。因此有必要持續(xù)監(jiān)測(cè)，同時(shí)擴(kuò)大監(jiān)測(cè)的范圍，使監(jiān)測(cè)情況更全面準(zhǔn)確。

4 結(jié) 論

本研究根據(jù)2019-2021年采集自6個(gè)省市養(yǎng)殖場(chǎng)的近800株腸球菌的MIC數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析得出了動(dòng)物源腸球菌對(duì)吉他霉素、黃霉素、恩拉霉素、那西肽、阿維拉霉素、維吉尼亞霉素和桿菌肽的流行病學(xué)臨界值分別為8、8、8、0.25、8、8和32 μg/mL。本研究建立了腸球菌對(duì)飼用抗菌促生長(zhǎng)劑耐藥情況的初步判定標(biāo)準(zhǔn)，為進(jìn)一步制定耐藥折點(diǎn)，監(jiān)測(cè)“禁抗”前后腸球菌對(duì)抗菌促生長(zhǎng)劑的耐藥率變化提供了參考。